Diversidade funcional de bactérias isoladas de solos rizosférico e não rizosférico em cultura de milho

This study evaluated the hydrolytic and phosphate-solubilizing potentials of soil bacteria isolated from a red latosol (oxisol) under maize cultivation. Rhizosphere soil (SR) and non-rhizosphere soil (NR) were collected and, subsequently, distinct bacterial colonies were isolated in pure cultures. Solid culture media were employed to evaluate production of hydrolases and phosphate solubilization by the isolates. From SR and NR, 30 and 19 distinct colonial types were isolated, respectively. From 29 SR isolates, 68.9%, 65.5%, 20.7% and 24.1% displayed proteolytic, cellulolytic, amylolytic, and phosphate-solubilizing activities, respectively. From the NR isolates, 57.9% produced cellulase, 42.1% protease, 57.9% amylase and 21.0% solubilized phosphate; however, 31.6% of these isolates did not display any activity. Diverse bacteria presented combined activities, representing about 58% of the SR and NR isolates. In addition to environmental and agricultural relevance, the microbial ability to secrete enzymes related to carbon and nitrogen cycles and phosphate solubilization might be important from a biotechnological perspective.Este estudo avaliou os potenciais hidrolítico e de solubilização de fosfato de bactérias isoladas de Latossolo Vermelho cultivado com milho. A coleta de solo rizosférico (SR) e solo não rizosférico (NR) foi realizada, sendo procedido o isolamento de colônias bacterianas em culturas puras. Meios de cultura sólidos foram utilizados na avaliação da produção de hidrolases e solubilização de fosfato pelos isolados. A partir de SR e NR foram isolados 30 e 19 tipos coloniais distintos, respectivamente. De 29 isolados de SR, 68,9%, 65,5%, 20,7% e 24,1% apresentaram atividade proteolítica, celulolítica, amilolítica e solubilização de fosfato, respectivamente. Dos isolados de NR, 57,9% produziram celulase, 42,1% protease, 57,9% amilase e 21,0% solubilizaram fosfato; contudo, 31,6% destes isolados não demonstraram qualquer atividade. Diversas bactérias apresentaram atividades combinadas, representado aproximadamente 58% dos isolados de SR e NR. Além da relevância ambiental e agrícola, a habilidade microbiana em secretar enzimas relacionadas ao ciclo do carbono e nitrogênio e a solubilização de fosfato podem ser importantes na perspectiva biotecnológica

Production of Proteolytic Enzymes by a Keratin-Degrading Aspergillus niger

A fungal isolate with capability to grow in keratinous substrate as only source of carbon and nitrogen was identified as Aspergillus niger using the sequencing of the ITS region of the rDNA. This strain produced a slightly acid keratinase and an acid protease during cultivation in feather meal. The peak of keratinolytic activity occurred in 48 h and the maximum proteolytic activity in 96 h. These enzymes were partly characterized as serine protease and aspartic protease, respectively. The effects of feather meal concentration and initial pH on enzyme production were evaluated using a central composite design combined with response surface methodology. The optimal conditions were determined as pH 5.0 for protease and 7.8 for keratinase and 20 g/L of feather meal, showing that both models were predictive. Production of keratinases by A. niger is a less-exploited field that might represent a novel and promising biotechnological application for this microorganism

Keratinolytic potential and characterization of an extracellular keratinase from Bacillus sp. P45

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima.Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability

Characterization of a Monascuc purpureus beta-glucosidase

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG.β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis

Keratinolytic potential and characterization of an extracellular keratinase from Bacillus sp. P45

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima.Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability

Characterization of a Monascuc purpureus beta-glucosidase

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG.β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis

Produção de uma beta-glicosidase extracelular por Monascus purpureus

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Produção, purificação e caracterização de uma beta-glicosidase extracelular de monascus purpureus

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