Einzelmolekül-spektroskopische Methoden zur Untersuchung von Dynamiken des STAT5b-Proteins in lebenden Maus Fibroblasten

Das Zusammenspiel der verschiedenen Organe in einem komplexen System wie dem menschlichen Körper erfordert fein aufeinander abgestimmte Steuer- und Kontrollmechanismen. Der JAK/STAT Signalweg ist einer der direktesten Informations-Übertragungswege von extrazellulären Botenstoffen, die das Signal über die Zellmembran in das Zytosol bis in den Zellkern zu den jeweiligen Zielgenen weiterleiten. Der Wachstumsfaktor Epo spielt unter anderem in der Erythropoese in Zusammenhang mit dem EpoR und dem Signalprotein STAT5b eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit wird das STAT5b-Protein in lebenden NIH3T3 Maus Fibroblasten hinsichtlich seiner Diffusion im Zytosol und im Zellkern und bezüglich der Bindungseigenschaften an seinen aktivierenden Rezeptor (EpoR) untersucht. Die Experimente werden mit den Einzelmolekül-spektroskopischen Methoden FCS und „VA-TIRF“ durchgeführt. Hierfür muss zunächst eine geeignete Farbstoffmarkierung des STAT5b gefunden werden. Die Verwendung eines Fusionsproteins aus STAT5b und fluoreszierendem mCherry bietet eine spezifische und stöchiometrische Markierung. Allerdings zeigt mCherry in den Versuchen eine ausgeprägte Fluktuation in seiner Emission, das so genannte „Blinken“, und eine geringe Photostabilität. Damit ist das Fluoreszenzprotein für FCS-Messungen nur bedingt geeignet. Für DIFIM, eine Methode die durch punktweise FCS-Analysen ein Raster von relativen Diffusionszeiten eines Ausschnitts einer Zelle anfertigt, ist STAT5b-mCherry ungeeignet. Um die Untersuchungen der Diffusion und Bindung des STAT5b dennoch erfolgreich durchzuführen wird es mit dem SNAP-Tag-Protein fusioniert, welches dann mit dem organischen Farbstoff TMR-Star stöchiometrisch markiert wird. In dieser Arbeit konnte ein Markierungsprotokoll etabliert werden, welches sicherstellt, dass die Markierung spezifisch und das Signalübertragungsprotein funktional ist. Die FCS-Messungen im Zytosol und Zellkern ergeben für unterschiedlich behandelte Zellen verschiedene Diffusionskoeffizienten (D). Für unbehandelte und gehungerte Zellen sind die mittleren D im Zytosol schneller als im Zellkern. Nach der Aktivierung des Signalwegs mit Epo kehrt sich das Verhältnis um und der mittlere D im Zellkern nimmt zu. Wahrscheinlich führt die Dimerisierung des aktivierten Proteins zu einer Verringerung, während die Bindung des aktivierten STAT5b-Dimers an die DNA im Zellkern vermutlich zu der Erhöhung des D führt. Die Messungen mit „VA-TIRF“ zeigen für die Bindung des Proteins an der Zellmembran keine einheitliche Bindungszeit und auch keinen Unterschied hinsichtlich Epo-stimulierten und -unstimulierten Zellen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass unspezifische Wechselwirkungen des STAT5b mit der Zellmembran und anderen Rezeptoren in der Zellmembran der Bindung mit dem EpoR überlagert sind. Bei der Analyse der gesamten Aktivität des Proteins an der Zellmembran zu verschiedenen Zeitpunkten nach Epo-Stimulierung ergibt sich ein Aktivitätsmaximum bei 7,5 min. In den Bindungs-An-Zeiten des STAT5b ist hingegen kein Unterschied zu erkennen. Die gesteigerte STAT5b-Aktivität ließe sich durch verkürzte Bindungs-Aus-Zeiten des Proteins zum EpoR oder durch eine erhöhte Anzahl der Rezeptoren in der Zellmembran infolge der Epo-Stimulierung erklären. In Übereinstimmung zeigen Untersuchungen der Phosphorylierung von STAT5b durch V. Becker et. al. die maximale Phosphorylierung bei 7.5 min durch eine erhöhte Rekrutierung von EpoR aus dem zytosolischen Pool an die Zellmembran. Videoaufnahmen mittels „Variable-Angle-TIRF“ mit Belichtungszeiten von nur 5 ms pro Einzelbild zeigten, dass es möglich ist über ImTIR-FCS-Analysen Diffusionskoeffizienten des STAT5b zu erhalten. Die Wechselwirkung mit der Zellmembran wird durch die langsame Diffusion des Proteins widergespiegelt, die mit 1,4 – 2,4 µm2/s zwischen der von zytosolischen und Transmembran -Proteinen liegt. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten und der Verlauf der STAT5b-Aktivität können im Weiteren in Modelle für den JAK/STAT Signalweg eingefügt werden und so den Ablauf der Aktivierung in diesem System verdeutlichen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum tieferen Einblick in die Signalweiterleitung

PLEKHS1 drives PI3Ks and remodels pathway homeostasis in PTEN-null prostate

The PIP3/PI3K network is a central regulator of metabolism and is frequently activated in cancer, commonly by loss of the PIP3/PI(3,4)P2 phosphatase, PTEN. Despite huge research investment, the drivers of the PI3K network in normal tissues and how they adapt to overactivation are unclear. We find that in healthy mouse prostate PI3K activity is driven by RTK/IRS signaling and constrained by pathway feedback. In the absence of PTEN, the network is dramatically remodeled. A poorly understood YXXM- and PIP3/PI(3,4)P2-binding PH domain-containing adaptor, PLEKHS1, became the dominant activator and was required to sustain PIP3, AKT phosphorylation, and growth in PTEN-null prostate. This was because PLEKHS1 evaded pathway-feedback and experienced enhanced PI3K- and Src-family kinase-dependent phosphorylation of Y258XXM, eliciting PI3K activation. hPLEKHS1 mRNA and activating Y419 phosphorylation of hSrc correlated with PI3K pathway activity in human prostate cancers. We propose that in PTEN-null cells receptor-independent, Src-dependent tyrosine phosphorylation of PLEKHS1 creates positive feedback that escapes homeostasis, drives PIP3 signaling, and supports tumor progression

Aplicação do método de varredura na roteirização de frota em uma empresa de transporte e distribuição de cargas fracionadas

The increasing volume of e-commerce is associated with the operational efficiency of the logistics of fractional loads, given that delivery reliability for products is one of the decisive factors at the time of acquisition by consumers. Thus, the transportation and distribution of products must serve the customer quickly, consistently, and with low costs, which results in the need to choose the best possible route. In this study, we developed a tool for fleet routing in a less-than-truckload transportation company by applying the sweep algorithm with the aid of ArcGIS® software. The company currently uses an empirical method based on the experience gained in daily operations over the years. The lack of a methodology had been generating losses to the organization due to inefficient routes. As result, the proposed model reduced costs by 25.8% and routes by 18.3%

Future Swedish 3D City Models : Specifications, Test Data, and Evaluation

Three-dimensional city models are increasingly being used for analyses and simulations. To enable such applications, it is necessary to standardise semantically richer city models and, in some cases, to connect the models with external data sources. In this study, we describe the development of a new Swedish specification for 3D city models, denoted as 3CIM, which is a joint effort between the three largest cities in Sweden—Stockholm, Gothenburg, and Malmö. Technically, 3CIM is an extension of the OGC standard CityGML 2.0, implemented as an application domain extension (ADE). The ADE is semantically thin, mainly extending CityGML 2.0 to harmonise with national standards; in contrast, 3CIM is mainly based on linkages to external databases, registers, and operational systems for the semantic part. The current version, 3CIM 1.0, includes various themes, including Bridge, Building, Utility, City Furniture, Transportation, Tunnel, Vegetation, and Water. Three test areas were created with 3CIM data, one in each city. These data were evaluated in several use-cases, including visualisation as well as daylight, noise, and flooding simulations. The conclusion from these use-cases is that the 3CIM data, together with the linked external data sources, allow for the inclusion of the necessary information for the visualisation and simulations, but extract, transform, and load (ETL) processes are required to tailor the input data. The next step is to implement 3CIM within the three cities, which will entail several challenges, as discussed at the end of the paper

Future Swedish 3D City Models—Specifications, Test Data, and Evaluation

Three-dimensional city models are increasingly being used for analyses and simulations. To enable such applications, it is necessary to standardise semantically richer city models and, in some cases, to connect the models with external data sources. In this study, we describe the development of a new Swedish specification for 3D city models, denoted as 3CIM, which is a joint effort between the three largest cities in Sweden—Stockholm, Gothenburg, and Malmö. Technically, 3CIM is an extension of the OGC standard CityGML 2.0, implemented as an application domain extension (ADE). The ADE is semantically thin, mainly extending CityGML 2.0 to harmonise with national standards; in contrast, 3CIM is mainly based on linkages to external databases, registers, and operational systems for the semantic part. The current version, 3CIM 1.0, includes various themes, including Bridge, Building, Utility, City Furniture, Transportation, Tunnel, Vegetation, and Water. Three test areas were created with 3CIM data, one in each city. These data were evaluated in several use-cases, including visualisation as well as daylight, noise, and flooding simulations. The conclusion from these use-cases is that the 3CIM data, together with the linked external data sources, allow for the inclusion of the necessary information for the visualisation and simulations, but extract, transform, and load (ETL) processes are required to tailor the input data. The next step is to implement 3CIM within the three cities, which will entail several challenges, as discussed at the end of the paper