Tristhiolato Pseudopeptides Bind Arsenic(III) in an AsS 3 Coordination Environment Imitating Metalloid Binding Sites in Proteins

The AsIII binding of two NTA-based tripodal pseudopeptides, possessing three cysteine (ligand L1) or D- penicillamine residues (ligand L2) as potential coordinating groups for soft semimetals or metal ions, was studied by experimental (UV, CD, NMR, and ESI-MS) and theoretical (DFT) methods. All of the experimental data, obtained with the variation of the AsIII:ligand concentration ratios or pH values in some instances, evidence the exclusive formation of species with an AsS3-type coordination mode. The UV-monitored titration of the ligands with arsenous acid at pH = 7.0 provided an absorbance data set that allowed for the determination of apparent stability constants of the forming species. The obtained stabilities (logK ' = 5.26 (AsL1) and logK ' = 3.04 (AsL2)) reflect high affinities, especially for the sterically less restricted cysteine derivative. DFT calculated structures correlate well with the spectroscopic results and, in line with the 1H NMR data, indicate a preference for the all-endo conformers resembling the AsIII environment at the semimetal binding sites in various metalloproteins

Quantification of surface GalNAc ligands decorating nanostructured lipid carriers by UPLC-ELSD

Nanoparticles have been extensively studied for drug delivery and targeting to specific organs. The functionalization of the nanoparticle surface by site-specific ligands (antibodies, peptides, saccharides) can ensure efficient recognition and binding with relevant biological targets. One of the main challenges in the development of these decorated nanocarriers is the accurate quantification of the amount of ligands on the nanoparticle surface. In this study, nanostructured lipid carriers (NLC) were functionalized with N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) units, known to target the asialoglycoprotein receptor (ASGPR). Different molar percentages of GalNAc-functionalized surfactant (0%, 2%, 5%, and 14%) were used in the formulation. Based on ultra-high-performance liquid chromatography separation and evaporative light-scattering detection (UPLC-ELSD), an analytical method was developed to specifically quantify the amount of GalNAc units present at the NLC surface. This method allowed the accurate quantification of GalNAc surfactant and therefore gave some insights into the structural parameters of these multivalent ligand systems. Our data show that the GalNAc decorated NLC possess large numbers of ligands at their surface and suitable distances between them for efficient multivalent interaction with the ASGPR, and therefore promising liver-targeting efficiency

Recent advances in uranyl binding in proteins thanks to biomimetic peptides

International audienc

Mimer le vivant pour piéger les radionucléides

International audienceLes peptides sont très utilisés en chimie médicinale car ils présentent de nombreux avantages pour des utilisations in vivo par rapport aux molécules purement synthétiques. Comme les protéines, ils sont solubles dans les fluides biologiques et leur dégradation conduit à des acides aminés bio-compatibles, ce qui limite leur toxicité. Des peptides aux séquences bien choisies peuvent mimer la structure des protéines et donc reproduire des interactions moléculaires essentielles dans le vivant, entre deux protéines ou entre des protéines et l'ADN par exemple. Mimer ces interactions permet non seulement d'étudier les mécanismes du vivant mais aussi de bloquer certaines réactions biologiques indésirables, un point crucial pour qui veut mettre au point des médicaments inhibant ces réactions. Les peptides peuvent également piéger-ou chélater-des ions métalliques. À ce titre, ils sont donc des candidats intéressants pour mettre au point des molé- Les peptides sont des molécules qui ressemblent aux protéines présentes dans les organismes vivants. Ils sont constitués des mêmes briques élémentaires-les acides aminés-, liés entre eux par des liaisons amides primaires, dites « peptidiques » (figure p. 40). Il existe 20 acides aminés naturels, qui diffèrent par la nature de leur chaîne latérale. Ces acides aminés donnent naissance à de très nombreuses combinaisons, caractérisées par la grande variété de protéines du vivant. En général, on considère que les peptides possèdent moins de 70 à 80 acides aminés quand les protéines peu-vent être beaucoup plus longues. La présence de liaisons peptidiques dans les peptides et les protéines impose des structures tridimensionnelles particulières, mainte-nues par de nombreuses liaisons hydrogène. Les plus communes sont les structures en hélice α et en feuillet β, mais il existe aussi des structures aléatoires sans réelle organisation tridimensionnelle. cules visant à éliminer des métaux toxiques de l'organisme. Ces com-posés modèles sont également des outils très utiles pour étudier les interactions des métaux avec les protéines, interactions qui sont à l'origine de nombreux processus biologiques vitaux ou néfastes. PIÈGES À MÉTAUX De nombreux ions métalliques essentiels sont efficacement piégés ou chélatés dans des sites bien définis de protéines (1). Certains interviennent ainsi directement dans des réactions chimiques ou biologiques nécessaires à la vie, à l'instar du fer de l'hémoglobine sur lequel se fixe l'oxygène lors du processus de respiration, quand d'autres sont nécessaires pour imposer des structures particulières aux protéines, comme les doigts de zinc. Tout métal, même essentiel, peut néanmoins s'avérer toxique si sa concentration excède les valeurs physiologiques. La concentration cellulaire en métaux est donc finement régulée Utilisés ou produits par les centrales électronucléaires, les actinides sont des radionucléides sans aucune fonction biologique connue et sont toxiques à la fois par leurs propriétés chimiques et radiologiques. C'est pourquoi les chimistes élaborent des molécules pour les piéger à l'intérieur de l'organisme et limiter ainsi leur toxicité en cas de contamination suite à une exposition accidentelle. Une des approches utilisées pour éliminer les actinides de l'organisme repose sur des peptides mimant le vivant

Chelation therapy in Wilson's disease: from D-penicillamine to the design of selective bioinspired intracellular Cu(I) chelators

International audienceWilson's disease is an orphan disease due to copper homeostasis dysfunction. Mutations of the ATP7B gene induces an impaired functioning of a Cu-ATPase, impaired Cu detoxification in the liver and copper overload in the body. Indeed, even though copper is an essential element, which is used as cofactor by many enzymes playing vital roles, it becomes toxic when in excess as it promotes cytotoxic reactions leading to oxidative stress. In this perspective, human copper homeostasis is first described in order to explain the mechanisms promoting copper overload in Wilson's disease. We will see that the liver is the main organ for copper distribution and detoxification in the body. Nowadays this disease is treated life-long by systemic chelation therapy, which is not satisfactory in many cases. Therefore the design of more selective and efficient drugs is of great interest. A strategy to design more specific chelators to treat localized copper accumulation in the liver will then be presented. In particular we will show how bioinorganic chemistry may help in the design of such novel chelators by taking inspiration from the biological copper cell transporters

Synthèse et étude de nouveaux chélateurs sélectifs du cuivre (I) pour les maladies de type Wilson

Le cuivre est un élément essentiel à tout être vivant. il intervient en tant que cofacteur dans de nombreux processus biologiques. Cependant, en excès, il est toxique pour l'organisme et peut impliquer des réactions de type Fenton. Sa concentration dans les cellules est donc régulée par des protéines qui permettent son transport et son élimination. La maladie de Wilson est due à une anomalie au niveau d'une de ces protéines (rATP7B). C'est une maladie génétique, dont les deux parents sont porteurs sains. Elle entraîne une accumulation du cuivre dans le foie, le cerveau et les yeux. Cette maladie orpheline (1/30000 à 1/100000) présente des symptômes nombreux et souvent peu spécifiques à la maladie de Wilson. Les traitements actuels visent à diminuer l'absorption intestinale ou à augmenter l'excrétion urinaire du cuivre et doivent être suivis à vie. Ils ne visent absolument pas le foie qui est le premier organe touché et sont peu sélectifs du cuivre. Actuellement. il n'existe pas de traitement capable d'éliminer le cuivre directement au niveau du foie qui est le premier organe touché. Une molécule capable d'éliminer le cuivre en excès contenu dans les cellules du foie (hépatocytes) serait donc très utile pour soulager les malades. Pour cela, nous avons conçu des vecteurs comportant une partie ciblante pour pouvoir cibler le foie et une partie chélatante pour complexer le cuivre(l). Cette partie chélatante présente une forte affinité pour le cuivre(l) et une forte sélectivité Cu +/Zn2+. Ainsi, deux modèles de parties chélatantes basés sur deux et trois cystéines ont été synthétisés et des études de complexation du cuivre(l) mais aussi d'autres métaux divalents de configuration dlo ont été réalisés. Enfin, la vectorisation de ces modèles a été réalisée et des tests cellulaires ont été faits afin d'évaluer la complexation des ces vecteurs pour le cuivre(l) intracellulaire.Copper is an essential trace element which forms an integral component of many enzymes, but while trace amounts of copper are needed to sustain life, excess copper is extremely toxic (Fenton type reaction). Copper concentration is extremely regulated by proteins which carrier it and excrete il. Wilson disease is a genetic autosomal recessive disorder of copper transport, characterized by defective biliary copper excretion and resulting in copper accumulation, primarily in the liver but also in brain and cornea. Wilson disease occurs worldwide with an average prevalence of ~30 affected individuals per million population and symptoms at any age are frequently no specifie. Treatments for Wilson disease have concentrated on the use of chelators to reduce copper intestinal absorption and to promote its excretion by urine. They do not target liver, the tirst organ affected, and they are few copper selective. Nowadays, no treatments take over excess copper ofliver so a molecule which could capture copper of the liver will be fine to alleviate patients. Thus, we design new vectors which consist of two units: one targetting liver and th~ second chelating copper(l). The chelating unit exhibits a strong affinity for copper(l) and a good selectivity Cu+/Zn2+. Two chelators models on two or three cysteines-based were realized as well as the physicochemical characterization of their metaI complexes with copper and other divalents cations dlO. Then, the vectorization ofthese models was done as weIl as cellular tests 10 evaluate the availability of vectors to complex intracellular copper concentration.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Synthèse et étude de nouveaux chélateurs pour la détoxification d'ions métalliques d dans l'organisme

Ce travail de thèse a consisté à synthétiser de nouveaux chélateurs pour la complexation des ions métalliques d10 toxiques en milieu biologique, comme le cuivre (I), lorsqu'il est présent en excès dans les cellules, et le mercure (II), délétère à l'état de traces. En particulier, des tripodes à trois soufres, inspirés de tripodes fonctionnalisés par trois dérivés cystéine, développés antérieurement au laboratoire, ont été élaborés et leur propriétés de complexation avec le cuivre (I) ont été examinées. Comme les tripodes cystéines, les nouveaux tripodes fonctionnalisés par d'autres dérivés soufrés, en particulier des dérivés de D-Pénicillamine (D-PEN), sont capables de complexer le cuivre (I) dans des environnements CuS3 avec de fortes affinités et sélectivités par rapport au zinc (II) présent dans les milieux biologiques. Des études structurales approfondies effectuées par spectroscopie d'absorption des rayons X (XAS) ont permis de caractériser complètement les complexes et clusters de cuivre (I) formés, de corréler les mesures d'affinités effectuées en utilisant différentes techniques et de rationaliser les relations structure/ affinité observées. L'un des nouveaux tripodes a ensuite été fonctionnalisé pour être ciblé vers les cellules du foie, où une accumulation de cuivre est observée chez les patients atteints de la maladie de Wilson. Les premiers tests biologiques réalisés sur des cellules hépatiques ont montré que l'architecture fonctionnalisée ainsi conçue (CHEL4) est capable de complexer le cuivre (I) en excès in cellulo. Cette étude conforte les résultats obtenus antérieurement au laboratoire avec le tripode cystéine fonctionnalisé (CHEL2) et valide donc le système de vectorisation vers les hépatocytes. Les propriétés de complexation des nouveaux tripodes avec l'ion toxique mercure (II), plus gros et plus mou que l'ion cuivre (I), ont aussi été étudiées. Il a ainsi été établi que les nouveaux tripodes thiolates peuvent aussi stabiliser un environnement trigonal autour du mercure (II). Notre étude a donc montré comment des tripodes soufrés de faible poids moléculaire, judicieusement fonctionnalisés, peuvent accommoder des environnements trigonaux très stables autour des ions mous cuivre (I) et mercure (II). De tels environnements miment plus ou moins les sites trigonaux du cuivre (I) et du mercure (II) trouvés dans les protéines à cuivre (I) (Ctr1, Mac1, Ace 1, COX ), les protéines bactériennes de détoxification du mercure (II) (Mer-R), et les métallothionéines (MTs), petites protéines riches en cystéines qui complexent les ions métalliques en excès ou toxiques dans les cellules. Ces analogies avec les complexes métalliques biologiques permettent de rationnaliser les fortes affinités des nouveaux tripodes pour les ions mous cuivre (I) et mercure (II). Plus généralement, notre étude apporte des règles de design moléculaires pour concevoir des architectures efficaces dédiées à la détoxification des métaux mous en milieu biologiques. Mots clés : cuivre (I), zinc (II), mercure (II), maladie de Wilson, foie, surcharges métalliques, toxicité, chélateurs, tripodes soufrés, cystéine, D-pénicillamine (D-PEN), environnements trigonaux, protéines du cuivre (I), métallothionéines (MTs), Mer-R, Spectroscopie d'Absorption des rayons X (XAS).This work consisted in the syntheses of new chelators for the binding of soft d10 metal ions in biological media, such as the copper (I) ion, toxic at high levels in the cells, and the mercury (II) ion, deleterious even at low concentrations. In particular, new suphur-based tripodal architectures, derived from the cysteine-based architectures previously designed at the laboratory, have been synthetized and their binding properties with the copper (I) ion have been looked into. As the cysteine-based scaffolds, the new chelators, based on new sulphur compounds, in particular D-Penicillamine (D-PEN) derivatives, complex the copper (I) ion in trigonal CuS3 environments with high affinities and high selectivities with respect to the bioavailable zinc (II) ion. In depth structural studies have been performed by X-Ray Absorption Spectroscopy (XAS) to fully characterize the copper (I) complexes and the copper (I) clusters formed in solution, to correlate the affinity measurements performed using different analytical techniques and to rationalize structure/ affinity relationships. One of the new chelators has been functionalized to be targeted to the liver cells, where copper (I) overloads are observed when people suffer from the Wilson's disease. The first biological experiments carried out in hepatocytes, have shown that the functionalized chelator (CHEL4) complexes excess copper (I) in cellulo. This study supports the results previously obtained with the functionalized cysteine-based architecture (CHEL2) and thus validates the targeting system. The binding properties of the new tripodal architectures with the mercury (II) ion, bulkier and softer than the copper (I) ion, have also been studied. It has been established that the new chelators also stabilize trigonal environments around the mercury (II) ion. Thus this study has shown how low molecular weight sulphur-based tripodal architectures, judiciously functionalized, are able to adapt stable sulphur-only trigonal environments around the soft metal ions, copper (I) and mercury (II). Such environments reproduce more or less the trigonal binding sites found in copper (I) proteins (Crt1, Mac1, Ace1, COX ), bacteria proteins dedicated to mercury (II) detoxification (Mer-R) and metallothioneins (MTs), which are small cysteine-rich proteins in charge of the detoxification of toxic metal ions in cells. Those structural analogies shared with the biological metallic complexes allow us to rationalize the high affinities of the new tripodal architectures for soft metal ions. In a more extended point of view, this study brings some guidelines of molecular design to elaborate efficient chelators dedicated to the detoxification of soft metal ion in biological media. Keywords: copper (I), zinc (II), mercury (II), Wilson's disease, liver, metal overloads, toxicity, chelators, sulphur-based tripods, cysteine, D-penicillamine (D-PEN), trigonal environments, copper (I) proteins, metallothioneins, Mer-R, X-Ray Absorption Spectroscopy (XAS).SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

A Constrained Tetrapeptide as a Model of Cu(I) Binding Sites Involving Cu4S6 Clusters in Proteins

Peptide design is an efficient strategy to create relevant models of natural metal binding sites found in proteins. The two short tetrapeptides Ac-Cys-DPro-Pro-Cys-NH2 (CDPPC) and Ac-Cys-Pro-Gly-Cys-NH2 (CPGC) were synthesized and studied as mimics of Cu(I) binding sites involved in Cu homeostasis. Both sequences contain beta turn inducing motifs to rigidify the peptide backbone structure and thereby preorganize the metal-binding side chains. The more constrained structure of the peptide CDPPC with respect to CPGC was evidenced by the measurements of the temperature coefficients of the amide protons by H-1 NMR, which suggest a solvent-shielded intramolecular hydrogen bond in CDPPC, and no H-bond in CPGC. The Cu(I) complexes were studied by UV, circular dichroism (CD), and NMR spectroscopies as well as electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) experiments in aqueous solution at physiological pH. The complexes formed with CPGC showed a complicated speciation with the possible formation of many polymetallic species. By contrast, the better preorganization in CDPPC leads to the formation of a unique Cu4L3 complex involving a Cu4S6 core. The formation of this specific cluster was confirmed by ESI-MS and by diffusion-ordered NMR spectroscopy in solution. The affinity of CDPPC for Cu(I) (beta(PH7.4)(11) = 10(17.5) calculated for a CuL complex) is more than 1 order of magnitude larger than the affinity measured for the less constrained peptide CPGC. Besides, this stability constant value is very similar to those reported with proteins. Therefore, the Cu(I) complex formed with the simple tetrapeptide CDPPC in water at physiological pH represents a very good model of Cu(I)-thiolate clusters found in proteins. The extremely large selectivity (10(11)) in favor of Cu(I) with respect to Zn(II), an abundant competitor in cells, makes it a promising candidate to be targeted to the liver cells for the localized treatment of Cu overload in Wilson's disease