A SUCLA2 mutációk szerepe a mitokondrium foszforilációs rendszerének betegségeiben = The Role of SUCLA2 Mutations in the Disorders of the Mitochondrial Phosphorylation System

Ami a SUCLA2 knock-out egerek használatát illeti, az állatok létrehozása még mindig folyamatban van, annak ellenére, hogy a kifizetés teljes egészében megtörtént. Amint megérkeznek az állatok, munkacsoportunk elsődleges feladata a tervben szereplő, eddig el nem végzett kísérletek végrehajtása lesz. Mindemellett jelentős előrehaladás történt két másik transzgenikus kolónia (DLD +/- és DLST +/-) tekintetében, mint azt a részletes jelentésben is leírtuk. A COS-7 és HEK293 sejteken tervezett siRNS-sel történő SUCLA2 elcsendesítést illetően eddig 4 különböző szekvenciát próbáltunk ki, de nem tapasztaltunk velük elcsendesedést. A citoszolikus/nukleáris ATP mérést illetően egy Japán kutatócsoport 11 plazmidot állított elő, melyekről kimutatták, hogy alkalmasak citoszolikus, nukleáris és mitokondriális ATP mérésére FRET alapú indikátorokként. A plazmidok nemrégiben érkeztek meg, jelenleg a mennyiség növelésén dolgozunk. A (iii) célkitűzést illetően, mely szerint SUCLA2 mutációban szenvedő betegek fibroblasztjain kísérletezünk: ezeket telomeráz gén általi immortalizálás nélkül felhasználtuk. Ahogyan azt az előzetes eredmények alapján is jósoltuk, azt találtuk, hogy SUCLA2 mutációban szenvedő betegekből származó fibroblasztok mitokondriumai gátolt légzési lánc mellett depolarizációt mutatnak bongkreksav hatására, ami az ANT korai megfordulására utal. | Regarding the aim using SUCLA2 knock out mice, this transgenic animal is still on the process of being generated, even though it has been paid in full. As soon as the mice will arrive in our facility, it will be a top priority to perform all remaining proposed experiments. However, significant progress on two other transgenic mouse colonies, DLD+/- and DLST+/-, as mentioned in the detailed progress report. Regarding siRNA against SUCLA2 in COS-7 and HEK293 cells, we have tried 4 different sequences; however, we have not observed any silencing. Regarding measurements of cytosolic/nuclear ATP, 11 plasmids have been generated by a Japanese group, shown to report cytosolic, nuclear, or mitochondrial ATP levels, operating as FRET-based indicators we have just obtained the plasmids, and we are currently expanding them in quantities. Regarding aim (iii), using fibroblasts from patients suffering from SUCLA2 mutations, we used them as such without immortalizing them by inserting a telomerase gene. Our findings showed that -as predicted by the preliminary results- fibroblasts obtained from patients suffering from SUCLA2 mutations exhibited bongkrekic acid-induced depolarizations in respiration-impaired in situ mitochondria, implying premature ANT reversals

Az intermedier anyagcsere és a szabadgyökképzés kapcsolata izolált idegvégkészülékekben és mikroglia sejtekben. = Correlation between intermediary metabolism and free radical formation in isolated nerve endings and in microglial cells

Izolált idegvégkészülékeken végzett kísérleteink alapján valószínűsítettük, hogy citrát-kör alfa-ketoglutarát dehidrogenáz enzimének szerepe lehet a reaktív oxigénszármazékok (ROS) képzésében. Ezt a feltételezést izolált enzimen végzett vizsgálatokkal megerősítettük. Megállapítottuk, hogy a ROS képzést a hipoxiás körülmények között észlelhető NADH/NAD arány növekedés erősen stimulálja. Vizsgáltuk a NADH-t termelő citrát-köri szubsztrátokkal, illetve a szukcináttal légző mitokondriumok ROS-képző tulajdonságait, a mitokondrium membránpotenciál és a ROS termelés közötti összefüggést. Rámutattunk, hogy a kvalitatíven is különböző irodalmi eredmények oka a preparátumok eltérő membránpotenciál-ja. Karakterizáltuk a mitokondrium-citoszól kapcsolatban fontos szerepet játszó glicerofoszfát inga működése során az alfa-glicerofoszfát (a-GP) mitokondriális oxidációja során képződő hidrogén peroxid keletkezési mechanizmusát, és megállapítottuk, hogy az a-GP ROS-képzése történhet mind reverz elektron transzporttal, mind pedig magán az alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz (a-GPDH) enzimen. Kimutattuk, hogy az a-GPDH-n történő ROS-képzés jelentősen stimulálható a citoplazmatikus [Ca2+] fiziológiás tartományban történő emelésével. Megállapítottuk, hogy az idegvégkészülékekben "in situ" elhelyezkedő mitokondriumok ROS képzése a membránpotenciál csökkentésével nem befolyásolható, mely eredmény nem támasztja alá a membránpotenciál csökkentésére alapozott neuroprotekció elméletét. | Our group demonstrated that Krebs cycle enzyme alpha-ketoglutarate dehydrogenase (a-KGDH) was able to generate H2O2 and thus, could be a source of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria. ROS production was stimulated by the high NADH/NAD ratio mimicking hypoxic conditions. Relationship between ROS formation and mitochondrial membrane potential (mMP) was studied in isolated mitochondria respiring on NADH-linked substrates and succinate. The rate of H2O2 formation with NADH-linked substrates was sensitive to changes in mMP only in highly polarized mitochondria, while mMP could determine both the mechanism and the intensity of ROS generation in succinate-supported mitochondria. Alpha-glycerophosphate (a-GP) shuttle has a role in the oxidation of cytosolic NADH in mitochondria. We suggest that oxidation of a-GP leads to ROS generation both by reverse electron transport (RET), and by the direct ROS formation on the a-GP-dehydrogenase (a-GPDH) enzyme. In a-GP-supported mitochondria activation of a-GPDH by Ca2+ leads to an accelerated RET-mediated ROS generation as well as to a stimulated ROS production on the a-GPDH. In nerve terminals we tested whether ROS generation by "in situ" mitochondria, functioning in a normal cytosolic environment and oxidize glucose-derived substrates, is also dependent on changes in mMP. Basal ROS generation by "in situ" mitochondria is not sensitive to changes in mMP, challenging the rational of the "mild uncoupling" theory for neuroprotection

Környezetszennyező anyagok hatásának vizsgálata elemi- és komplex idegi folyamatokra = Effect of environmental toxicants on the elementary and complex neuronal processes

A bensultap és fipronil széles körben alkalmazott, ún. második generációs rovarölőszer, melyek ligand-vezérelt ioncsatorna receptorokon fejtik ki hatásukat. Vizsgáltuk e két hatóanyag idegrendszerben kifejtett hatását, és elemeztük annak időbeli változását. Néztük az egyszeri, nagy dózisban, intragasztrikusan alkalmazott rovarölőszerek idegi aktivitásra, valamint a közvetlen idegsejtekre kifejtett hatást in vitro rendszerekben. Míg a bensultap időlegesen csökkentette az alap ingerelhetőséget, a fipronil épp az ellenkező hatást váltotta ki. Az alvás mélysége és a viselkedésmintázat is megváltozott a kezelést követő napokban. A bensultap lecsökkentette az Ach kiváltotta áram amplitudóját, az anyag koncentrációjának és az előkezelés idejének függvényében. A deszenzitizációs idő a koncentráció növelésével nőtt. A fipronil a Lymnaea légzési hálózatát módosította, megnőttek az inter-spike időintervallumok. A bensultap fiziológiás állapotból kiindulva, ha már kialakult a rohamtevékenység, prokonvulzív hatást fejtett ki. A fipronil serkentette az epileptiform tevékenység indukcióját, valamint fokozta a már kialakult görcstevékenység fenntartását és terjedését az emlős agykéregben. A már görcstevékenységet mutató idegrendszer fokozottan volt érzékeny a fipronil kezelésre. | Bensultap and fipronil are widely used second generation insecticides which act on different ligand-gated ion channels. The aim of the present study was to investigate neuromodulatory effects and time- course of these compounds. The effect of single, large dose intragastrically or in vitro directly applied insecticides on mammalian neuronal excitability was tested. While bensultap temporarily decreased the basic neuronal excitability, fipronil caused the opposite effect. Following the treatments both sleep pattern and behavior were affected. The amplitude of currents induced by Ach is decreased by bensultap. The degree of inhibition depends on the preapplication time and the concentration of the chemical. The kinetic parameters of the Ach-induced currents are altered by Bensultap, the desensitization time is increased in a concentration-dependent manner. Our data indicate an elevated seizure susceptibility and higher probability for generalisation of epileptiform activity in the bensultap treated animals. Fipronil facilitates the induction and maintenance of seizure activity and promotes their generalisation in both pretreated and treated animals, although it was less proconvulsive in the pre-treated animals. Rotenone restrained the induction and maintenance of seizure activity in pre-treated animals, in contrary seizure activity was facilitated when rotenone was applied during already ongoing activity

Elektron transzfer rendszerek élettani szerepe = The physiological role of electron transfer systems

Fagocitákban leírtuk a NADPH oxidázt szabályozó két különböző GTPáz aktiváló fehérje szabályozását és a kísérő K+ transzport baktérium ölő hatását. Agyi mitokondriumokban (mito) a légzési lánc I. komplexének szubsztrátjai membránpotenciál (Em) függően reaktív oxigénszármazékot (ROS) képeznek. Az alfa-glicerofoszfát (aGP) ROS-t képez az I. komplexen és az aGP-dehidrogenáz enzimen, utóbbit a Ca2+ aktivája. Idegvégződésekben a mito ROS képzését az Em nem befolyásolja. A mito-k elektromos szincíciumot képeznek, de a Ca2+ diffúziója korlátozott. Alacsony O2.- szint a Ca2+ -mobilizáló agonista Ca2+ jel képző hatását glomerulóza sejtben gátolja. A ROS támadáspontja a belső raktárból történő Ca2+ felszabadulás. UV hatására a mito Ca2+ felvétele is csökkent. Angiotenzin II -vel ingerelt H295R sejtben a mito Ca2+ jel képzés sebessége a mito és az endoplazmás retikulum (ER) közelségével korrelál. A p38 MAPK és az újtípusú PKC izoformák egyidejű gátlása a Ca2+ jelnek a citoszolból a mito-ba történő áttevődését gátolja és a fenti korrelációt megszünteti. Az ER lumenében a tiol/diszulfid rendszertől elkülönülő NAD(P)+/NAD(P)H rendszer működik. Redox állapotát a glukóz-6-foszfát transzporter és az intraluminális oxidoreduktázok határozzák meg. A redukált állapot fenntartása szükséges a glukokortikoidok prereceptoriális aktiválásához, s egyes sejtekben antiapoptotikus hatású. Jellemeztük az ER szulfát transzporterét, valamint a transzlokon peptid csatorna anion permeabilitását. | We described in phagocytes the regulation of two GTPase activating proteins, terminating the activity of plasmalemmal NADPH oxidase and the role of K+ movements in bacterial killing. In brain mitochondria complex I dependent substrates show a membrane potential (Em) dependent reactive oxygen species (ROS) formation. ROS production by alpha-glycerophosphate (aGP) occured at complex I and on the aGP-dehydrogenase enzyme. The latter is activited by Ca2+. Mitochondria form an electric syntitium but the diffusion of Ca2+ is limited. In glomerulosa cells, at low [O2.-] angiotensin-induced Ca2+ signalling is attenuated, the site of ROS action is Ca2+ release from the internal stores. The rate of mitochondrial Ca2+ uptake in angiotensin-stimulated cells correlates with the vicinity of the mitochondrion and the endoplasmic reticulum (ER). Simultaneous activation of p38 MAPK and the novel isoforms of PKC attenuates the transfer of cytosolic Ca2+ signal into the mitochondria and abolishes this correlation. In the ER we observed a novel NAD(P)+/NAD(P)H system different from the thiol/disulphide system. Its reduced state is tuned by the glucose-6-phosphate transporter and the luminal oxidoreductases and is required for the prereceptorial activation of glucocorticoids. We have characterized the sulphate transport in the ER, and the contribution of the translocon peptide channel to the membrane permeation of small anions

Fungaemia caused by Candida pulcherrima

Although neonatal bloodstream infections may be caused by a variety of fungi, invasive fungaemia due to Candida pulcherrima in a premature neonate has not been previously reported. We describe such a case in which antifungal susceptibility test data led to successful therapy. A colonized catheter used for parenteral nutrition is presumed to have been the main source of this persistent infection. © 2012 ISHAM

Súlyos koponya-agy sérültek ellátása Magyarországon, 2002-ben = Management of patients with severe head injury in Hungary, in 2002

Hazánkban a koponya-agy sérülésekkel kapcsolatos epidemiológiai és klinikai adatok meglehetősen hiányosak. A Magyar Neurotraumatológiai Társaság célul tűzte ki, hogy átfogó tanulmányt készít a hazai súlyos koponya-agy sérültek számáról, halálozásáról, ellátásának szervezettségéről, a használatos diagnosztikus és monitorizálási lehetőségekről, valamint a meglévő klinikai gyakorlatról. Kérdőíves módszerrel az egész országra kiterjedő, a 2001-es év adataira vonatkozó retrospektív és három hónapos, prospektív esetelemző adatgyűjtést végeztek a 2002-es évben. A helyszíni ellátás és a szállítás adatainak rögzítését az Országos Mentőszolgálat központilag szervezte meg, míg a kórházi ellátási adatok összegyűjtése regionális koordinátorok és kórházi adatközlők hálózatával történt. A válaszolók az ország kórházi neurotraumatológiai ellátásának 76%-át fedték le. A koponya-agy sérültek évi száma közel 14 000; 71,3%-uk az enyhe, 19,4%-uk a közepes, 9,4%-uk a súlyos kategóriába tartozott. A prospektív adatok szerint a kórházakba súlyosként került koponya-agysérültek 55%-a, a másodlagosan súlyossá vált sérültek 35%-a halt meg az akut ellátás során, ami jóval magasabb, mint a világ fejlett részén közölt halálozási adatok. Ennek hátterében a prehospitális és a hospitális ellátás közötti kommunikációs zavar, a definitív ellátásig, illetve az első CT-vizsgálatig eltelő extrém hosszú idő, illetve az áll, hogy a magyar és a nemzetközi ellátási irányelvek nem kerülnek széles körben alkalmazásra. In Hungary, epidemiological and clinical data regarding brain injury were rather scarce. The Hungarian Society for Neurotrauma aimed to make a nation-wide study about the number and the mortality of patients with severe head trauma, the organization of management, the diagnostics and monitoring in use, and finally about the clinical practice of management. A national survey was carried out with questionnaires asking about data of 2001, and a prospective, three-month-long data collection based on case studies was also executed in 2002. The Hungarian National Ambulance and Emergency Service centralized information gathering on rescue, and transportation. To collect data of hospital care, a network of regional coordinators and hospital communicators was developed. The responders covered 76% of the hospital neurotrauma care in the country. The number of brain trauma patients was close to 14,000 per year: 71.3% mild, 19.4% moderate, and 9.4% severe trauma. According to prospective study the mortality of those patients who were admitted as severe head injury patients was 55% and the mortality of those who got into severe condition later was 35% during the acute care. These data showed much worse outcome than those published in Western European countries and North America. In the background the authors found communication disorder between prehospital and hospital care, extreme long time spent until the patients got to the first CT-exam and to the definitive care. The implementation of Hungarian and international head trauma guidelines did not spread widely

The negative impact of alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex deficiency on matrix substrate-level phosphorylation

A decline in alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) activity has been associated with neurodegeneration. Provision of succinyl-CoA by KGDHC is essential for generation of matrix ATP (or GTP) by substrate-level phosphorylation catalyzed by succinyl-CoA ligase. Here, we demonstrate ATP consumption in respiration-impaired isolated and in situ neuronal somal mitochondria from transgenic mice with a deficiency of either dihydrolipoyl succinyltransferase (DLST) or dihydrolipoyl dehydrogenase (DLD) that exhibit a 20-48% decrease in KGDHC activity. Import of ATP into the mitochondrial matrix of transgenic mice was attributed to a shift in the reversal potential of the adenine nucleotide translocase toward more negative values due to diminished matrix substrate-level phosphorylation, which causes the translocase to reverse prematurely. Immunoreactivity of all three subunits of succinyl-CoA ligase and maximal enzymatic activity were unaffected in transgenic mice as compared to wild-type littermates. Therefore, decreased matrix substrate-level phosphorylation was due to diminished provision of succinyl-CoA. These results were corroborated further by the finding that mitochondria from wild-type mice respiring on substrates supporting substrate-level phosphorylation exhibited approximately 30% higher ADP-ATP exchange rates compared to those obtained from DLST+/- or DLD+/- littermates. We propose that KGDHC-associated pathologies are a consequence of the inability of respiration-impaired mitochondria to rely on "in-house" mitochondrial ATP reserves.-Kiss, G., Konrad, C., Doczi, J., Starkov, A. A., Kawamata, H., Manfredi, G., Zhang, S. F., Gibson, G. E., Beal, M. F., Adam-Vizi, V., Chinopoulos, C. The negative impact of alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex deficiency on matrix substrate-level phosphorylation