Rapporto tecnico sulla ottimizzazione del processo di biosintesi di una Green Fluorescent Protein ricombinante estratta da A. sulcata

L’espressione di geni eterologhi in Escherichia coli rappresenta uno dei metodi più veloci, semplici ed economici per la produzione di ampie quantità di proteine target. Tuttavia, meccanismi di folding e le modifiche post traduzionali inducono a volte un non corretto ripiegamento delle proteine nella conformazione nativa, con successiva aggregazione in quelli che vengono definiti corpi di inclusione. Nel nostro caso, l’attenzione è stata focalizzata su una Green Fluorescent Protein (GFP) di 228 aa estratta da Anemonia sulcata, contenente un fluoroforo composto da tre amminoacidi Gln63, Tyr64, Gly65 all'interno di una struttura a barile. Il corretto folding della proteina era correlato strettamente alla funzionalità del fluoroforo. Il nostro obiettivo è stato quello, quindi, di ottimizzare il processo di biosintesi della GFP espressa in E. coli, ovviando alla formazione di corpi di inclusione contenenti la proteina (non funzionale), definendo e standardizzando inoltre, le condizioni che consentivano di produrre la più alta percentuale di GFP correttamente ripiegata (in condizioni non denaturanti) e quindi funzionale

Importancia de los fenómenos físicos y la disponibilidad de nutrientes en el control de la concentración de clorofila estimada por satélite en el área costera de afloramiento del Canal de Sicilia

The northern sector of the Sicilian Channel is an area of favourable upwelling winds, which ought to support primary production. However, the values for primary production are low when compared with other Mediterranean areas and very low compared with the most biologically productive regions of the world’s oceans: California, the Canary Islands, Humboldt and Benguela. The aim of this study was to identify the main factors that limit phytoplankton biomass in the Sicilian Channel and modulate its monthly changes. We compared satellite-based estimates of chlorophyll a concentration in the Strait of Sicily with those observed in the four Eastern Boundary Upwelling Systems mentioned above and in other Mediterranean wind-induced coastal upwelling systems (the Alboran Sea, the Gulf of Lions and the Aegean Sea). Our results show that this low level of chlorophyll is mainly due to the low nutrient level in surface and sub-surface waters, independently of wind-induced upwelling intensity. Further, monthly changes in chlorophyll are mainly driven by the mixing of water column and wind-induced and/or circulation-related upwelling processes. Finally, primary production limitation due to the enhanced stratification processes resulting from the general warming trend of Mediterranean waters is not active over most of the coastal upwelling area off the southern Sicilian coast.El sector norte del Canal de Sicilia es un área de vientos favorables para el afloramiento, lo cual debe favorecer la producción primaria. Sin embargo, los valores de producción primaria son bajos comparados con otras áreas del Mediterráneo y muy bajos comparados con las regiones biológicamente más productivas de los océanos a nivel mundial: California, Canarias, Humboldt y Benguela. El objetivo de este estudio fue identificar los principales factores que limitan la biomasa del fitoplancton y modulan sus cambios mensuales. Comparamos estimas de la concentración de clorofila a basadas en satélite en el estrecho de Sicilia, con las observadas en los cuatro sistemas orientales de afloramiento mencionados anteriormente y en otros sistemas costeros del Mediterráneo en los que el viento favorece los afloramientos (Mar del Alborán, Golfo de León y Mar Egeo). Nuestros resultados muestran que la baja producción primaria es debida principalmente a la baja entrada de nutrientes en aguas superficiales, independientemente de la intensidad del afloramiento causado por el viento. Por otro lado, los cambios mensuales en la producción primaria se deben a la mezcla de la columna de agua y afloramientos asociados al viento y/o procesos de circulación en la zona. Finalmente, la limitación de la producción primaria debida al aumento del proceso de estratificación resultante de la tendencia general de calentamiento de las aguas del Mediterráneo, no es activa a lo largo de la mayor parte del área de afloramiento en la costa sur de Sicilia

Environmental Conditions along Tuna Larval Dispersion: Insights on the Spawning Habitat and Impact on Their Development Stages

Estimated larval backward trajectories of three Tuna species, namely, Atlantic Bluefin Tuna (Thunnus thynnus, Linnaeus, 1758), Bullet Tuna (Auxis Rochei, Risso, 1801) and Albacore Tuna (Thunnus alalunga, Bonnaterre, 1788) in the central Mediterranean Sea, were used to characterize their spawning habitats, and to assess the impact of changes due to the major environmental parameters (i.e., sea surface temperature and chlorophyll-a concentration) on larval development during their advection by surface currents. We assumed that the environmental variability experienced by larvae along their paths may have influenced their development, also affecting their survival. Our results showed that the Tuna larvae underwent an accelerated growth in favorable environmental conditions, impacting on the notochord development. In addition, further updated information on spawning and larval retention habitats of Atlantic Bluefin Tuna, Bullet and Albacore Tunas in the central Mediterranean Sea were delivered

Development of a biosensor for copper detection in aqueous solutions using an Anemonia sulcata recombinant GFP

Fluorescent proteins from marine organisms represent potential candidates for biosensor development. In this paper, we described the isolation of a native green fluorescent protein from Anemonia sulcata and the cloning and purification of its equivalent as a recombinant protein in Escherichia coli. Furthermore, the spectroscopic behaviours of the native and recombinant GFPs were investigated as a function of Cu2+, Cd2+, Pb 2+ and Ni2+ concentration. Our results suggest the high selectivity of both proteins at copper than the other metals and, for the recombinant protein, a great sensitivity at a very low concentration (0.1-1 μM). Moreover, starting from these data, using the combination of molecular biology techniques and optical setup, we developed a device for the detection of Cu2+ in water solutions. The quenching effect detected with the device showed that the relative attenuation of the signal (0.46±0.02 AU) was slightly larger than the data measured by fluorescence spectra (0.65±0.03 AU). The good sensitivity in the span of two orders of the magnitude of Cu2+ concentration, the fact that the instrument is made up of low-cost and sturdy parts and the selective quenching of rAsGFP to copper ions make this setup suited as a low cost, on-the-field, copper ion-specific biosensor. © 2013 Springer Science+Business Media

Procedures for high quality RNA extraction from Paracentrotus lividus (LAMARCK, 1816) embryos and gonadal tissue

The extraction protocol described below is part of the CISAS project, aimed at the realization, within CNR, of an “International Centre of advanced study in environment, ecosystem and human health”. In this report we describe a RNA extraction protocol from Paracentrotus lividus embryos and gonadal tissue

Applicazione di un veloce metodo di estrazione del DNA per l’identificazione di prodotti ittici marini.

L'identificazione dei prodotti ittici è uno dei temi chiave in materia di sicurezza alimentare. L’errata etichettatura dei prodotti alimentari e la sostituzione di alcuni ingredienti rappresentano questioni emergenti in termini di qualità e sicurezza alimentare e nutrizionale. L'autenticazione e la tracciabilità dei prodotti alimentari, gli studi di tassonomia e di genetica di popolazione, così come l'analisi delle abitudini alimentari degli animali e la selezione delle prede, si basano su analisi genetiche tra cui la metodica molecolare del DNA barcoding, che consiste nell’amplificazione e nel sequenziamento di una specifica regione del gene mitocondriale chiamata COI. Questa tecnica biomolecolare è utilizzata per fronteggiare la richiesta di determinazione specifica e/o la reale provenienza dei prodotti commercializzati, nonché per smascherare errori di etichettatura e sostituzioni fraudolente, difficile da rilevare soprattutto nei prodotti ittici trasformati. Sul mercato sono disponibili differenti kit per l'estrazione del DNA da campioni freschi e conservati; l’impiego dei kit, aumenta drasticamente il costo dei progetti di caratterizzazione e di genotipizzazione dei campioni da analizzare. In questo scenario è stato messo a punto un metodo veloce di estrazione del DNA. Esso non prevede nessuna fase di purificazione per i prodotti ittici freschi e trasformati e si presta a qualsiasi analisi che preveda l’utilizzo della tecnica PCR. Il protocollo consente l'amplificazione efficiente del DNA da qualsiasi scarto industriale proveniente dalla lavorazione del pesce, indipendentemente dal metodo di conservazione del campione. L’applicazione di questo metodo di estrazione del DNA, combinato al successo e alla robustezza della amplificazione PCR (secondo protocollo barcode) ha permesso di ottenere, in tempi brevissimi e con costi minimi, il sequenziamento del DNA

Amino acid composition in eyes from zebrafish (Danio rerio) and sardine (Sardina pilchardus) at the larval stage

A comparative study was performed to identify differences in the amino acid composition of the eyes from zebrafish (Danio rerio) and sardine (Sardina pilchardus) larvae and their link to the environmental adaption of the species. Amino acids in the acidic hydrolysates of eyes from 11 zebrafish and 12 sardine were determined with the use of high-performance liquid chromatography involving precolumn derivatization with ortho-phthalaldehyde. Differences in the content of most amino acids were detected between zebrafish and sardine. These amino acids were aspartate, glutamate, serine, glycine, threonine, arginine, methionine, valine, phenylalanine, isoleucine, leucine and lysine. Of particular note, the percentage of methionine in zebrafish eyes was much higher than that in sardine, whereas the opposite was observed for glutamate and glycine. These results indicate that zebrafish and sardine likely have experienced differences in adaptation to environmental changes. We suggest that the amino acid composition of eyes represents a powerful tool to discriminate between species characterized by different lifestyle and inhabiting different environments