Caracterizacion molecular de aislamientos de sweepovirus que infectan Ipomoea batatas (L.) Lam. y estudio de sinergismo con el sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV).

Los sweepovirus forman un grupo dentro del genero Begomovirus que se caracterizan por infectar solo a camote, los cuales comunmente causan infeccion asintomatica, pasando inadvertidos, por lo que su prevalencia y distribucion es desconocida en algunas regiones del mundo. Las infecciones multiples son sinergicamente con otros virus. En el presente estudio, se obtuvieron 48 secuencias a partir de fragmentos de PCR usando cebadores universales para sweepovirus de un total de 239 muestras de camote mantenidas en el banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP). Se seleccionaron y caracterizaron los genomas completos de seis aislamientos de sweepovirus: Peru-6, Mexico-31, Cuba-5, San Vicente, Peru-10 y Jamaica-12, utilizando PCR en sentido inverso para los cuatro primeros aislados y por la polimerasa Phi29 para los ultimos dos. La comparacion completa de los genomas confirmo que los seis virus eran bastante diferentes entre si con un 89 % de identidad a excepcion de Jamaica-12 y Cuba-5 (91 %), y San Vicente y Peru-10 (93 %). Se realizo una evaluacion del sinergismo de cada uno de ellos con el aislamiento M2-47 del SPCSV durante un periodo de 10 semanas. Esta se realizo mediante la expresion de sintomas en plantas de camote variedad "Huachano" con infecciones simples (sweepovirus) y dobles (sweepovirus + SPCSV). La deteccion de los sweepovirus se realizo mediante la prueba de hibridacion de acidos nucleicos y por RT-PCR en tiempo real el SPCSV. Se encontro que existe un sinergismo con una magnitud considerablemente variable entre los titulos de los diferente aislados de sweepovirus y que en la mayoria de los casos no se asocio con sintomas claros. La informacion obtenida en este estudio puede contribuir al diagnostico e identificacion de sweepovirus y el aumento de sus titulos presente en algunas interacciones sinergicas sugiere que pueden tener un impacto en el rendimiento y esto debe ser una prioridad para estudio futuros

Desarrollo y aplicacion de PCR multiple para la deteccion simultanea de tres virus de ADN en camote (Ipomoea batatas L.)

El virus colusivo del camote (SPCV, genero Cavemovirus), el virus del aclaramiento de venas del camote (SPVC, genero Solendovirus) y el virus del enrollamiento de hojas del camote (SPLCV, genero Begomovirus) son virus con genoma de ADN, presentes en el camote en infecciones virales simples o multliples. La identificacion y deteccion de estos virus es complicada, ya que con frecuencia son asintomaticos y estan en concentraciones bajas en las plantas de camote. Se desarrollo una PCR multiple (mPCR) con el objetivo de lograr la deteccion simultanea de SPVC, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados); para ellos se seleccionaron cebadores especificos para SPCV y SPVCV, y se utilizaron cebadores degenerados para Begomovirus (desarrollados por Li et al. 2004). Para la optimizacion de parametros se usaron plantas de camote con infecciones simples y mixtas. Se optimizo la concentracion de cebadores (0,1-0, 3uM), MgCl2 (2,5-8,0mM), dNTPs (0.2-0.8 mM), Taq-polimerasa (2-4U), parametros en el termociclador (temperatura de hibridacion de 48-62 oC y el numero de ciclos de 29-35), y la cantidad de acidos nucleidos (50-300 ng). Para validar le mPCR se uso plantas de camote de una coleccion de germplasma in vitro que estaban infectados con los virus en estudio y fueron confirmados por clonacion y secuenciamiento de las amplificaciones obtenidas. Los pares de cebadores especificos seleccionados para cada virus pudieron amplificar fragmentos de ADN en tamanos esperados, a una concentracion final de 0.16 uM para cebadores de SPCV y SPVCV, y 0.2uM para SPLCV. Ademas la concentracion de ADN adecuada esta entre 50-100 ng, con 30 ciclos termicos y 53 oC de temperatura de hibridacion. Este ensayo demostro ser simple, sensible y confiable para el diagnostico de rutina de SPCV, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados). El ensayo de mPCR sera util para programas de cuarentena, como un metodos rapido y rentable para un gran numero de muestras

Detection of Ralstonia solanacearum phylotype II, race 2 causing Moko disease and validation of genetic resistance observed in the hybrid plantain FHIA-21

Vascular wilt of banana and plantains, also known as Moko disease, is caused by Ralstonia solanacearum (Rs) phylotype II, and is the main bacterial disease affecting these crops in the Americas. Upon comparative sequence analysis of 44 Rs genomes we developed an improved PCR protocol based on the nucleotide sequence of a gene coding for a hypothetical DUF3313 domain protein. Next, we tested the detection protocol with two Rs inoculation methods to validate field resistance reported in the hybrid plantain genotype FHIA-21, previously identified as susceptible to Moko disease in greenhouse experiments in which wounds were caused to the roots prior to inoculation. By using an inoculation method without causing wounds to the roots, we confirmed resistance of FHIA-21 to Moko disease (no Rs was detected by PCR in inoculated plants). In contrast, the field-susceptible genotype Dominico Hartón developed severe symptoms of Moko disease, regardless of the inoculation method used. FHIA-21 showed an area under the disease progress curve (AUDPC) close to zero, while Dominico Hartón plants showed AUDPC values ranging from 65.8 to 88.4. The availability and analysis of genomic data facilitates the development of improved pathogen detection tools that together with the availability of improved inoculation methods and tolerant genotypes to Moko disease will be of great use in Musa breeding programs

Complete genome sequence of bean leaf crumple virus, a novel begomovirus infecting common bean in Colombia

A copy of the complete genome of a novel bipartite begomovirus infecting common bean (Phaseolus vulgaris L.) in Colombia was obtained by rolling-circle amplification (RCA), cloned, and sequenced. The virus is associated with leaf crumple symptoms and significant yield losses in Andean and Mesoamerican beans. Such symptoms have been reported increasingly in Colombia since at least 2002, and we detected the virus in leaf material collected since 2008. Sequence analysis showed that the virus is a member of a distinct species, sharing 81% and 76% nucleotide (nt) sequence identity (in DNA-A and DNA-B, respectively) to other begomoviruses infecting common bean in the Americas. The data obtained support the taxonomic status of this virus (putatively named ’bean leaf crumple virus’, BLCrV) as a member of a novel species in the genus Begomovirus. Begomoviruses (family Geminiviridae) are emergent pathogens of crops whose dissemination has been favoured by the increasing populations of their whitefly vectors [1]. In the Americas, a series of whitefly-transmitted begomoviruses have been reported to affect bean crops, and most have been associated to leaf mosaic symptoms and important yield reductions [1, 2]. In Colombia, distinct symptoms of leaf crumpling have been reported in fields of dry and snap bean varieties since 2002 [3]. Since then, there has been a drastic decrease (60-70%) in the cultivated area in localities where the symptoms have been reported [3, 4]. The most recent outbreak was recorded during December 2015 in Rozo, Department of ‘Valle del Cauca’ (Colombia), with a prevalence of 40% in fields of ‘Blue Lake’ beans, a popular but extremely susceptible commercial variety (Fig. 1A). The putative begomovirus causing the disease was originally named “virus del arrugamiento foliar” (Spanish for ‘leaf crumple virus’) [3], but the complete sequence was not available until now