Protein foszfatáz Z regulátor fehérjék vizsgálata Candida albicans-ban

A protein foszfatáz Z a szerin/treonin protein foszfatáz enzimcsaládba tartozó gomba specifikus protein foszfatáz, amit az opportunista patogén Candida albicans-ban a CaPPZ1 gén kódol. A gén terméke a CaPpz1 fehérje szerepet játszik a stressz válasz és a gombafonalak (hífa) növekedésének szabályozásában, ezért orvosbiológiai jelentőséggel bír. Munkám célja a foszfatáz regulációjának felderítése. Irodalmi adatok alapján ismeretes volt, hogy Saccharomyces cerevisiae-ben a ScHal3 és ScVhs3 fehérjék gátolják a foszfatáz Z aktivitását. Ezek a gátló fehérjék a hasonló szerkezetű ScCab3 fehérjével együtt részt vesznek a Coenzim A bioszintézisében is. Szekvencia hasonlóság alapján C. albicans-ban két nagyon hasonló fehérjét találtunk amelyeket CaHal3 és CaCab3 névvel láttunk el. Munkám során fehérje-fehérje interakciós vizsgálatokat végeztem a CaPpz1 és a lehetséges gátló fehérjék közötti kölcsönhatások kimutatására. A glutation-Sepharose 4B gyantához GST-cimkével ellátott rekombináns CaHal3 és CaCab3 fehérjéket kötöttem, majd a gyantát His-cimkével rendelkező CaPpz1 fehérjével inkubáltam. A foszfatáz kikötődését mosás és elúció után Western blot módszerrel detektáltam. Eredményeim szerint mind a CaHal3, mind a CaCab3 képes a CaPPZ1-hez kötődni. Ezzel összhangban a laboratórium munkatársai enzim aktivitás mérésekkel igazolták, hogy a CaHal3 és CaCab3 is képes gátolni a CaPpz1 foszfatáz aktivitását. A fehérje kölcsönhatások fiziológiás szerepét hal3 deléciós mutáns S. cerevisiae törzsben tanulmányoztam. Megvizsgáltam, hogy a CaHal3 és CaCab3 fehérjék expressziója hogyan befolyásolja a mutáns törzs életképességét só (LiCl) és sejtfal károsító anyag (Hygromicin B) által kiváltott stressz körülmények között. Azt tapasztaltam, hogy a várakozással ellentétben a CaCab3 fehérje komplementálta az ScHal3 hiányát, míg a szerkezetileg jobban hasonló CaHal3 fehérjének nem volt hatása. Konklúzióként elmondható, hogy bár az in vitro mérések szerint a C. albicans CaHal3 és CaCab3 fehérje egyaránt képesek a CaPpz1 foszfatázhoz kötődni in vivo körülmények között csak a CaCab3 bizonyult hatékonynak. Tehát az általunk megvizsgált két gombafajban a foszfatáz Z regulációját valószínűleg más fehérjék valósítják meg.MSc/MAmolekuláris biológiamagyarBiokémia-genomikanappal

A TRADD és TRAF2 fehérjék interakciójának vizsgálata AlphaScreen technika segítségével

A TRAIL, (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) sejthalál receptorokat aktiváló természetes ligand. Ez a fehérje a rákterápiában ígéretes eszköz lehet, ugyanis a legtöbb rákos sejtben szelektíven képes p53 független apoptózist indukálni. A TRAIL kötődése receptoraihoz (DR4 és DR5) un. halált indukáló jelátviteli komplex (DISC) felépülését indítja el. A DISC-ben a DR4/DR5 receptorhoz FADD (FAS Associated Death Domain) adapter fehérjén keresztül kaszpáz 8/10 proteolítikus enzimek kötődnek be és aktiválódnak. Ezek az iniciátor kaszpázok azután további fehérjék hasítása, aktiválása (DN-áz, végrehajtó kaszpáz) révén indítják be a sejt önpusztító gépezetét. A TRAIL DR4/5 receptorokon keresztül túlélési illetve gyulladásos folyamatokat aktiváló jelet is indíthat többek között az NF-kB (Nuclear Factor-kappa-B) aktiválása révén. NF-kB aktiváció a FADD, TRADD (TNF Receptor Associated Death Domain), TRAF2 (TNF Receptor Associated Factor 2), cIAP1/2 (Cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2) illetve a RIP1 (Receptor interacting protein 1) fehérjék interakciójának eredményeként jön létre. Dr Szegezdi Éva (Apoptosis Research Center, National University of Ireland, Galway) laboratóriumában folytatott korábbi kísérletekben kimutatták, hogy egyes tumor sejtekben az NF-kB gátlása révén fokozható a TRAIL indukálta apoptózis érzékenység. Céljuk olyan inhibitorotokat találni, amelyek a TRADD–TRAF2 interakció szintjén gátolják TRAIL által közvetített NF-kB aktivációt, azonban nem befolyásolják a kaszpáz-8 közvetítette apoptótikus útvonalat. Munkám során a TRADD-TRAF2 fehérjék interakciójának in vitro vizsgálatához optimalizáltam AlphaScreen (PerkinElmer) technikára épülő módszert. Az AlphaScreen fluoreszcens emisszión alapuló módszer, ahol a mért jel erőssége a Donor és az Akceptor gyöngyök közelségével arányos. Ezek a gyöngyök Nikkel, Streptactin, Streptavidin, illetve antitest molekulákkal vannak konjugálva, amelyek képesek kötődni a rekombináns TRADD illetve TRAF2 fehérjék megfelelő „tag”-jeihez. Így a TRADD és TRAF2 fehérjék interakciója quantitatíve követhető. Kísérleteim során különböző jelölésekkel ellátott humán rekombináns TRADD és TRAF2 fehérjéket expresszáltattam baktériumokban és a kitisztított fehérjék segítségével optimalizáltam az AlphaScreen mérést.BSc/BAorvosi laboratóriumi és képalkotó diagnosztikai analitikusmagyarOrvosi kutatólaboratóriumi analitikanappaliP.J

LAPTM4B gene copy number gain is associated with inferior response to anthracycline-based chemotherapy in hormone receptor negative breast carcinomas

PURPOSE: To determine the associations between lysosomal-associated transmembrane protein 4b (LAPTM4B) gene copy number and response to different chemotherapy regimens in hormone receptor negative (HR-) primary breast carcinomas. PATIENTS AND METHODS: Two cohorts were analyzed: (1) 69 core biopsies from HR-breast carcinomas treated with neoadjuvant chemotherapy (anthracycline based in 72.5% of patients and non-anthracycline based in 27.5% of patients). (2) Tissue microarray (TMA) of 74 HR-breast carcinomas treated with adjuvant therapy (77.0% of the patients received anthracycline, 17.6% of the patients non-anthracycline-based therapy, and in 5.4% of the cases, no treatment data are available). Interphase FISH technique was applied on pretreatment core biopsies (cohort I) and on TMAs (cohort II) using custom-made dual-labelled FISH probes (LAPTM4B/CEN8q FISH probe Abnova Corp.). RESULTS: In the neoadjuvant cohort in the anthracycline-treated group, we observed a significant difference (p = 0.029) of average LAPTM4B copy number between the non-responder and pathological complete responder groups (4.1 +/- 1.1 vs. 2.6 +/- 0.1). In the adjuvant setting, the anthracycline-treated group of metastatic breast carcinomas was characterized by higher LAPTM4B copy number comparing to the non-metastatic ones (p = 0.046). In contrast, in the non-anthracycline-treated group of patients, we did not find any LAPTM4B gene copy number differences between responder vs. non-responder groups or between metastatic vs. non-metastatic groups. CONCLUSION: Our results confirm the possible role of the LAPTM4B gene in anthracycline resistance in HR- breast cancer. Analyzing LAPTM4B copy number pattern may support future treatment decision

Investigating the Prognostic Relevance of Tumor Immune Microenvironment and Immune Gene Assembly in Breast Carcinoma Subtypes

We hypothesized that different BC subtypes are characterized by spatially distinct tumor immune microenvironment (TIME) and that immune gene assembly of metastatic (Met) and non-metastatic (Ctrl) BCs vary across subtypes. Peritumoral, stromal and intratumoral TIL was assessed on 309 BC cases. Hot, cold and immune-excluded groups were defined, and the prognostic role of this classification was assessed. CD4+/CD8+ positivity was analyzed in 75 cases in four systematically predefined tumor regions. Immune gene expression of Met and Ctrl HER2-negative BCs was compared by using NanoString nCounter technology. The amount of TIL infiltration varied greatly within all BC subtypes. Two-third of the cases were cold tumors with no significant survival difference compared to hot tumors. A lower CD4+/CD8+ ratio at the stromal internal tumor region was significantly associated with longer distant metastasis-free survival. The differentially expressed immune genes between Met and Ctrl varied across the studied BC subtypes with TNBC showing distinct features from the luminal subtypes. The TIME is characterized by a considerable heterogeneity; however, low level of TILs does not equate to disease progression. The differences in immune gene expression observed between Met and Ctrl breast carcinomas call attention to the important role of altered immune function in BC progression

Breast carcinoma subtypes show different patterns of metastatic behavior

The aim of our retrospective study was to analyze patterns of subtype specific metastatic spread and to identify the time course of distant metastases. A consecutive series of 490 patients with breast cancer who underwent surgery and postoperative treatment at Semmelweis University, Hungary, and diagnosed between the years 2000 and 2007 was identified from the archives of the 2nd Department of Pathology, Hungary. Molecular subtypes were defined based on the 2011 St. Gallen recommendations. Statistical analysis was performed with SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Distant metastasis free survival (DMFS) was defined as the time elapsed between the first pathological diagnosis of the tumor and the first distant metastasis detection. Distant metastases were detected in 124 patients. Mean time to develop metastasis was 29 months (range 0-127 months). The longest DMFS was observed in the Luminal A (LUMA) subtype (mean 39 months) whereas the shortest was seen in the HER2-positive (HER2+) subtype (mean 21 months; p = 0.012). We confirmed that HER2+ tumors carry a higher risk for distant metastases (42.1%). LUMA-associated metastases were found to be solitary in 59% of cases, whereas HER2+ tumors showed multiple metastases in 79.2% of cases. LUMA tumors showed a preference for bone-only metastasis as compared with HER2+ and triple negative breast cancer (TNBC) cases, which exhibited a higher rate of brain metastasis. The most frequent second metastatic sites of hormone receptor (HR) positive tumors were the lung and liver, whereas the brain was the most affected organ in HR-negative (HR-) cases. Tumor subtypes differ in DMFS and in pattern of distant metastases. HER2+ tumors featured the most aggressive clinical course. Further identification of subtype-specific factors influencing prognosis might have an impact on clinical care and decision-making