Die Rolle der Neuropeptide Calcitonin gene-related Peptide und Pituitary adenylate cyclase-activating Peptide im Superoxiddismutase 1 Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose

Bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) handelt es sich um eine tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, für die bisher keine effektiven Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen. Gekennzeichnet ist die ALS durch den Verlust der Motoneurone, der zur Denervierung der Muskulatur und letztendlich dem Tod durch Atemlähmung führt. Die molekularen Ursachen der ALS sind vielfältig und bis heute nur unzureichend aufgeklärt, aktuell stehen die Rolle der begleitenden Neuroinflammation und die molekularen Unterschiede zwischen ALS-vulnerablen und ALS-resistenen Motoneuronen im Zentrum der Forschung. Obwohl der neuroprotektive Einfluss verschiedener Neuropeptide in anderen neurodegenerativen Erkrankungen, Ischämie oder Axotomie lange bekannt ist, wurde deren Rolle bei der ALS bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Beteiligung der aussichtsreichsten Kandidaten Calcitonin gene-related Peptide (CGRP) und Pituitary adenylate cyclaseactivating Polypeptide (PACAP) am Krankheitsverlauf des SOD1G93A-Mausmodells der ALS aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu Axotomie oder peripherer Inflammation war in somatomotorischen Neuronen keine Hochregulation der CGRP-Expression in ALS-kranken Mäusen zu beobachten. Doch traten beginnend am postnatalen Tag (P) 40 CGRP-immunoreaktive Vakuolen in den Neuriten auf, die im Zeitverlauf deutlich an Volumen zunahmen und nach der Degeneration der Motoneurone frei im Neuropil vorlagen. Diese Veränderung der CGRPImmunoreaktivität ging dem Einsetzen der klinischen Symptomatik an P90-100 deutlich voraus und war räumlich und zeitlich eng mit einer Aktivierung der Astrozyten assoziiert. Zudem traten die Vakuolen, ebenfalls beginnend an P40, in extramotorischen Arealen wie dem Hypothalamus und der Substantia nigra auf. Da auch bei ALS-Patienten Störungen nigraler und extramotorischer Funktionen beobachtet werden, ist diese Beobachtung im Mausmodell ein wichtiger Hinweis darauf, dass es sich bei der ALS nicht ausschließlich um eine Motoneuronen-, sondern eine Multisystemerkrankung mit unterschiedlichen Subtypen handeln könnte. Desweiteren wurde mit CGRP erstmalig ein Biomarker für vulnerable Motoneurone identifiziert. So konnte gezeigt werden, dass es einerseits Motoneurone ohne CGRP-Expression (nonCGRP) gibt und diese gegen die ALS-Pathologie resistent zu sein scheinen, während andererseits Motoneurone mit starker oder schwacher CGRP-Expression (high und lowCGRP) im Zeitverlauf der Erkrankung selektiv degenerieren, und zwar umso früher und umso stärker, je mehr CGRP sie exprimieren. Die bisher vorgenommene Abgrenzung der resistenten, oculomotorischen Nuclei von den vulnerablen motorischen Nuclei im Hirnstamm resultiert ebenfalls aus der CGRP-Expression, da nachgewiesen werden konnte, dass sich die oculomotorischen Kerne in der Mehrheit aus nonCGRP-Neuronen zusammensetzen, während stark vulnerable Kerne wie der Nucleus ambiguus hauptsächlich aus highCGRP-Motoneuronen bestehen. Während eine Deletion von αCGRP keinen Effekt auf den Krankheitsverlauf des SOD1G93A-Mausmodell hatte, resultierte die Deletion der CGRP-spezifischen Rezeptorkomponente Receptor activity modifying protein 1 (RAMP1) in einem früheren motorischen Krankheitsbeginn mit einem anschließend verlangsamten Verlauf der Symptomatik. Histopathologisch waren diese Veränderungen mit einer reduzierten Neuroinflammation, insbesondere einer geringeren Aktivierung der Astrozyten und einem Ausbleiben der Lymphozyteninfiltration assoziiert. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass CGRP in der ALS-Pathologie einen stimulierenden Einfluss auf die Neuroinflammation hat und diese zu Beginn der Erkrankung einen protektiven, später einen toxischen Effekt auf die Motoneurone ausübt. Im bereits erkrankten Patienten könnte der therapeutische Einsatz von CGRP-Antagonisten ebenfalls einen hemmenden Einfluss auf die neurotoxischen Komponenten der Neuroinflammation ausüben und somit die Krankheitsprogression verlangsamen. Während Motoneurone auf Axotomie mit einer starken Induktion der PACAP-Expression reagieren, war im Zuge der hier untersuchten ALS-Pathologie nur in wenigen Einzelneuronen eine Induktion des Neuropeptids zu beobachten. In früheren Studien an anderen neuronalen Erkrankungen bzw. Schädigungen wie Morbus Parkinson und Alzheimer, Ischämie oder Axotomie hatte PACAP grundsätzliche eine neuroprotektive Wirkung, ein Unterbinden der Signalkaskade sollte also in einem progressiveren Krankheitsverlauf resultieren. Entgegen dieser Erwartung verlängerte sich bei der Einkreuzung einer PACAP-Defizienz in das SOD1G93A-Mausmodell die durchschnittliche Lebenserwartung der Tiere jedoch um ca. 5,5%. Im Gegensatz zu anderen neurdegenerativen Erkrankungen scheint PACAP in der ALS also keinen protektiven Effekt auszuüben, sondern die Pathogenese zu beschleunigen. Histopathologisch war im Endstadium SOD1G94A-transgener Tiere unter der PACAP-Deletion eine amöbiode Morphologie der Mikroglia zu beobachten, während PACAP-kompetente Tiere bereits hypertrophe und degenerierende Mikroglia aufwiesen. Dies deutete auf eine geringere oder verzögerte Aktivierung der Mikroglia in PACAP-defizienten Tieren hin. Die damit einhergehende Reduktion der neurotoxischen Wirkung der Neuroinflammation könnte die Verzögerung des Krankheitsverlaufs erklären. Entsprechend besitzt auch im Falle von PACAP der Einsatz von Antagonisten ein therapeutisches Potential bezüglich einer Hemmung der Krankheitsprogression in der ALS-Pathogenese

Die Rolle der Neuropeptide Calcitonin gene-related Peptide und Pituitary adenylate cyclase-activating Peptide im Superoxiddismutase 1 Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose

Bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) handelt es sich um eine tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, für die bisher keine effektiven Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen. Gekennzeichnet ist die ALS durch den Verlust der Motoneurone, der zur Denervierung der Muskulatur und letztendlich dem Tod durch Atemlähmung führt. Die molekularen Ursachen der ALS sind vielfältig und bis heute nur unzureichend aufgeklärt, aktuell stehen die Rolle der begleitenden Neuroinflammation und die molekularen Unterschiede zwischen ALS-vulnerablen und ALS-resistenen Motoneuronen im Zentrum der Forschung. Obwohl der neuroprotektive Einfluss verschiedener Neuropeptide in anderen neurodegenerativen Erkrankungen, Ischämie oder Axotomie lange bekannt ist, wurde deren Rolle bei der ALS bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Beteiligung der aussichtsreichsten Kandidaten Calcitonin gene-related Peptide (CGRP) und Pituitary adenylate cyclaseactivating Polypeptide (PACAP) am Krankheitsverlauf des SOD1G93A-Mausmodells der ALS aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu Axotomie oder peripherer Inflammation war in somatomotorischen Neuronen keine Hochregulation der CGRP-Expression in ALS-kranken Mäusen zu beobachten. Doch traten beginnend am postnatalen Tag (P) 40 CGRP-immunoreaktive Vakuolen in den Neuriten auf, die im Zeitverlauf deutlich an Volumen zunahmen und nach der Degeneration der Motoneurone frei im Neuropil vorlagen. Diese Veränderung der CGRPImmunoreaktivität ging dem Einsetzen der klinischen Symptomatik an P90-100 deutlich voraus und war räumlich und zeitlich eng mit einer Aktivierung der Astrozyten assoziiert. Zudem traten die Vakuolen, ebenfalls beginnend an P40, in extramotorischen Arealen wie dem Hypothalamus und der Substantia nigra auf. Da auch bei ALS-Patienten Störungen nigraler und extramotorischer Funktionen beobachtet werden, ist diese Beobachtung im Mausmodell ein wichtiger Hinweis darauf, dass es sich bei der ALS nicht ausschließlich um eine Motoneuronen-, sondern eine Multisystemerkrankung mit unterschiedlichen Subtypen handeln könnte. Desweiteren wurde mit CGRP erstmalig ein Biomarker für vulnerable Motoneurone identifiziert. So konnte gezeigt werden, dass es einerseits Motoneurone ohne CGRP-Expression (nonCGRP) gibt und diese gegen die ALS-Pathologie resistent zu sein scheinen, während andererseits Motoneurone mit starker oder schwacher CGRP-Expression (high und lowCGRP) im Zeitverlauf der Erkrankung selektiv degenerieren, und zwar umso früher und umso stärker, je mehr CGRP sie exprimieren. Die bisher vorgenommene Abgrenzung der resistenten, oculomotorischen Nuclei von den vulnerablen motorischen Nuclei im Hirnstamm resultiert ebenfalls aus der CGRP-Expression, da nachgewiesen werden konnte, dass sich die oculomotorischen Kerne in der Mehrheit aus nonCGRP-Neuronen zusammensetzen, während stark vulnerable Kerne wie der Nucleus ambiguus hauptsächlich aus highCGRP-Motoneuronen bestehen. Während eine Deletion von αCGRP keinen Effekt auf den Krankheitsverlauf des SOD1G93A-Mausmodell hatte, resultierte die Deletion der CGRP-spezifischen Rezeptorkomponente Receptor activity modifying protein 1 (RAMP1) in einem früheren motorischen Krankheitsbeginn mit einem anschließend verlangsamten Verlauf der Symptomatik. Histopathologisch waren diese Veränderungen mit einer reduzierten Neuroinflammation, insbesondere einer geringeren Aktivierung der Astrozyten und einem Ausbleiben der Lymphozyteninfiltration assoziiert. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass CGRP in der ALS-Pathologie einen stimulierenden Einfluss auf die Neuroinflammation hat und diese zu Beginn der Erkrankung einen protektiven, später einen toxischen Effekt auf die Motoneurone ausübt. Im bereits erkrankten Patienten könnte der therapeutische Einsatz von CGRP-Antagonisten ebenfalls einen hemmenden Einfluss auf die neurotoxischen Komponenten der Neuroinflammation ausüben und somit die Krankheitsprogression verlangsamen. Während Motoneurone auf Axotomie mit einer starken Induktion der PACAP-Expression reagieren, war im Zuge der hier untersuchten ALS-Pathologie nur in wenigen Einzelneuronen eine Induktion des Neuropeptids zu beobachten. In früheren Studien an anderen neuronalen Erkrankungen bzw. Schädigungen wie Morbus Parkinson und Alzheimer, Ischämie oder Axotomie hatte PACAP grundsätzliche eine neuroprotektive Wirkung, ein Unterbinden der Signalkaskade sollte also in einem progressiveren Krankheitsverlauf resultieren. Entgegen dieser Erwartung verlängerte sich bei der Einkreuzung einer PACAP-Defizienz in das SOD1G93A-Mausmodell die durchschnittliche Lebenserwartung der Tiere jedoch um ca. 5,5%. Im Gegensatz zu anderen neurdegenerativen Erkrankungen scheint PACAP in der ALS also keinen protektiven Effekt auszuüben, sondern die Pathogenese zu beschleunigen. Histopathologisch war im Endstadium SOD1G94A-transgener Tiere unter der PACAP-Deletion eine amöbiode Morphologie der Mikroglia zu beobachten, während PACAP-kompetente Tiere bereits hypertrophe und degenerierende Mikroglia aufwiesen. Dies deutete auf eine geringere oder verzögerte Aktivierung der Mikroglia in PACAP-defizienten Tieren hin. Die damit einhergehende Reduktion der neurotoxischen Wirkung der Neuroinflammation könnte die Verzögerung des Krankheitsverlaufs erklären. Entsprechend besitzt auch im Falle von PACAP der Einsatz von Antagonisten ein therapeutisches Potential bezüglich einer Hemmung der Krankheitsprogression in der ALS-Pathogenese

Spindly/CCDC99 Is Required for Efficient Chromosome Congression and Mitotic Checkpoint Regulation

Human Spindly is required for kinetochore localization of cytoplasmic dynein, which is essential for poleward movement of chromosomes and for kinetochore protein streaming. In addition, Spindly controls the activity and kinetochore abundance of the RZZ complex, which contributes to microtubule attachment and mitotic checkpoint activity

LTβR dependent growth suppressive activity also affects fully developed splenic tissue.

<p>(A) WT recipients without prior splenectomy were either sham operated or received WT or LTβR^-/- splenic implants. Eight weeks later weight (left side) and cell number (right side) of the endogenous spleen was determined. Only WT splenic regenerates significantly reduced weight and cell number of the endogenous WT spleen. Indicated are means and standard deviation (n = 4–11, * = p < 0.05, ** = p < 0.01). (B) LTβR^-/- recipients without prior splenectomy were either sham operated or received WT or LTβR^-/- splenic implants. Eight weeks later weight (left side) and cell number (right side) of the endogenous spleen was determined. Only WT splenic regenerates significantly reduced weight and cell number of the endogenous LTβR^-/- deficient spleen. Indicated are means and standard deviation (n = 5–8, ** = p < 0.01). These experiments were 2 times independently performed.</p

The splenic transplantation model.

<p>After removal of the endogenous spleen the recipient (WT or LTβR^-/-) receives a splenic implant which is composed of two pieces representing 50% of a WT or LTβR deficient spleen. The implanted splenic tissue first becomes necrotic because the blood supply is lacking. Then, formation of splenic tissue starts and within eight weeks splenic regeneration is completed.</p

Identification of LTβR regulated proteins by two-dimensional differential gel electrophoresis and mass spectrometry.

<p>(A) 2D-DIGE experiment performed with splenic stroma of LTβR^-/- (Cy3, green) and WT (Cy5, red) mice. The Cy2 channel is masked (representative gel of three replicas). The encircled area is shown in (B). (B) Gel section showing four spots with an increase in volume ratio when LTβR^-/- (left side) and WT (right side) splenic stroma was compared. Mass spectrometry identified the four spots as four isoforms of MFAP4 (representative gel of three replicas). (C) Indicated is the MFAP4 abundance in splenic stroma of LTβR^-/- spleen, LTβR^-/- spleen from a donor which received a WT splenic implant 8 weeks earlier (LTβR^-/- + WT), and WT spleen. The different 2D-DIGE experiments were compared quantitatively by summing up the volume ratios of the four isoforms of MFAP4 and relating it to the abundance of MFAP4 in LTβR^-/- splenic stroma which was set to one. The abundance of MFAP4 increased from LTβR^-/- splenic stroma to LTβR^-/- splenic stroma obtained from mice with a WT splenic regenerate and further to WT splenic stroma. Indicated are means and standard deviation (n = 3–6). This experiment was 2 times independently performed. (D) Western blot analysis of MFAP4 from splenic stroma lysates of LTβR^-/- mice, LTβR^-/- mice which received a WT splenic implant 8 weeks earlier (LTβR^-/- + WT), and WT mice. Three different sets of experiments are shown.</p

LTβR expression by non-splenic tissues suppresses growth of regenerating splenic tissue.

<p>(A) Macroscopic appearance of splenic regenerates 8 weeks after implantation of wild-type splenic tissue (WT) into wild-type recipients (WT), LTβR deficient splenic tissue (LTβR^-/-) into WT recipients, and WT splenic tissue into LTβR deficient recipients (LTβR^-/-). (B) Weight (left side) and cell number (right side) of splenic regenerates. Indicated are means and standard deviation (n = 4–9, ** = p < 0.01). (C) Microscopic appearance of splenic regenerates. Cryostat sections were stained by immunohistochemistry for T cells (brown; TCRβ⁺) and B cells (blue; B220⁺). Red pulp (RP), T-cell zone (T), and B-cell zone (B) are well developed except in the LTβR^-/- into WT combination where T and B cells are intermixed and only the red pulp (RP) is clearly recognizable (bar: 100 μm). This experiment was 3 times independently performed.</p

Architecture and cellular structure of WT spleen and WT into LTβR^-/- splenic regenerates are comparable.

<p>(A) The compartment sizes of normal WT spleens were analyzed and compared to that of splenic regenerates (WT→LTβR^-/-) 8 weeks after implantation. Indicated is the size of individual splenic zones as percent of total section area (n = 6–7 animals per group; RP: red pulp, MZ: marginal zone, WP: white pulp, T: T-cell zone, B: B-cell zone, T/B: mixed T/B-cell zone). (B) Frequency of leukocyte subsets in normal WT spleens and splenic regenerates (WT→LTβR^-/-) as determined by flow cytometry (n = 5–8 animals per group; B: B cells, IgD^- B: memory B cells, T: T cells; CD8: CD8⁺ T cells, CD4: CD4⁺ T cells, CD25: CD25⁺CD4⁺ -regulatory- T cells). (C) Expression of cytokines and chemokines in normal WT spleens and splenic regenerates (WT→ LTβR^-/-). Shown is the relative expression level normalized to the housekeeping gene (MLN 51) and relative to WT (fold expression change). The bars represent the mean values ± SD. Mann-Whitney <i>U</i> test was used to indicate a significant difference between WT spleens and splenic regenerates (*p < 0.05; ***p < 0.001).</p

MFAP4 does not suppress the regeneration of splenic implants.

<p>(A) WT and MFAP4 deficient recipients were splenectomized and then received a WT splenic implant. Eight weeks later the weight of the splenic regenerate was determined. No difference was seen between WT and MFAP4 deficient recipients. Indicated are means and standard deviation (n = 6). (B) WT and MFAP4 deficient recipients without prior splenectomy received a WT splenic implant. Eight weeks later the weight of the splenic regenerate was determined. No difference was seen between WT and MFAP4 deficient recipients. In addition, the suppressive activity of the endogenous spleen was similar in both groups (compare weights to the weights under A). Indicated are means and standard deviation (n = 6). These experiments were 2 times independently performed.</p