Rosmarinsäure-Biosynthese in Suspensionskulturen von Melissa officinalis L.

Die an der Rosmarinsäure-Biosynthese beteiligten Enzyme konnten bereits in Zellkulturen von Coleus blumei und verschiedenen Lamiaceen und Boraginaceen identifiziert und charakterisiert werden. Dennoch ist bislang wenig über die Regulationsmechanismen des Biosynthesewegs auf genomischer Ebene bekannt. Diese Arbeit sollte durch genaue Untersuchung der Rosmarinsäure-Biosynthese in einer diploiden Melissa officinalis-Suspensionskultur die Grundlage für die Aufklärung regulatorischer Mechanismen legen. Zu diesem Zweck waren eine genaue Charakterisierung der Zellkultur und die Charakterisierung der an der Biosynthese beteiligten Enzyme sowohl im Proteinrohextrakt als auch nach Klonierung und heterologer Expression in E. coli erforderlich. Rosmarinsäure, Hauptbestandteil der sogenannten Labiatengerbstoffe, ist ein Ester aus Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure, der im Pflanzenreich weit verbreitet anzutreffen ist. Für die Pflanzen erfüllt er vermutlich die Rolle eines konstitutiv gebilde-ten Abwehrstoffes zum Schutz vor Fraßfeinden. Die Biosynthese geht von den beiden Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin aus. Diese werden nach enzymatischer Umwandlung zu 4-Cumaroyl-CoA und 4-Hydroxyphenyllactat durch die Rosmarinsäure Synthase, einer Acyltransferase aus der Familie der BAHD-Enzyme, miteinander vere-stert und das Reaktionsprodukt durch anschließende 3- und 3’-Hydroxylierung zu Rosmarinsäure umgesetzt. Suspensionskulturen der Melisse sind in der Lage in kurzen Kulturperioden in Abhängigkeit vom Saccharosegehalt des Mediums bezogen auf das Zelltrockengewicht bis zu 7 % Rosmarinsäure zu akkumulieren (in Medium mit 4 % Saccharose). Durch Zugabe von Methyljasmonat ist eine weitere Steigerung möglich. Die Umwandlung des L-Phenylalanins zum Hydroxyzimtsäure-CoA-Ester erfolgt durch die Enzyme des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels: Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL), Zimtsäure 4-Hydroxylase (C4H) und Hydroxyzimtsäure:CoA-Ligase (4CL). Zusätzlich zur detaillierten Charakterisierung der nativen Enzyme gelangen Klonierung und Charakterisierung je einer PAL- und 4CL-Isoform. Für beide Enzyme konnte durch Southern Blotting die Existenz zweier Genkopien nachgewiesen werden. mRNA-Expressionsprofile, die sowohl für die PAL als auch für die 4CL über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen in Medium mit 2 % Saccharose erstellt wurden, weisen auf eine mögliche Beteiligung der klonierten Isoformen an der Rosmarinsäure-Biosynthese hin. Mithilfe der zur Klonierung verwendeten Volllängenprimer war es außerdem möglich, die genomischen Sequenzen beider Enzyme aufzuklären. Die genomische Sequenz der PAL weist ein charakteristisches Intron auf, welches in den PAL-Sequenzen der An-giospermen in einer konservierten Position zu finden ist. Die genomische Sequenz der klonierten 4CL ist hingegen Intron-frei. Katalysiert durch die Tyrosin Aminotransferase (TAT) wird L-Tyrosin zunächst in 4-Hydroxyphenylpyruvat umgewandelt. Die im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen ermittelten kinetischen Parameter korrelieren gut mit den Werten die bereits zuvor für das Enzym in Pflanzen (Coleus blumei, Anchusa officinalis), Säugetieren (Ratte) oder Protozoen (Trypanosoma cruzi) bestimmt wurden. Mithilfe der RACE-PCR konnte eine cDNA-Teilsequenz aufgeklärt werden, die große Übereinstimmung mit anderen TAT-Sequenzen aufweist. Durch ein weiteres Enzym, die sogenannte Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) wird das 4-Hydroxyphenylpyruvat zum Lactat reduziert. Die in Coleus blumei-Proteinrohextrakten ermittelten Substratpräferenzen dieses Enzyms konnten für das native Enzym aus Melissa officinalis bestätigt werden. Auch im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen wurde für 4-Hydroxyphenylpyruvat ein niedrigerer apparenter Km-Wert als für 3,4-Dihydroxyphenyllactat (5 µmol/l respektive 28 µmol/l) und für NADPH ein niedrigerer Wert als für NADH ermittelt (58 µmol/l respektive 90 µmol/l). Noch ungeklärt ist die Frage, ob es sich bei der HPPR um ein spezifisches Enzym des Rosmarinsäure-Biosynthesewegs handelt oder ob die Reaktion durch ein Enzym der Photorespiration, die cytosolische Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPR), katalysiert wird. Die Rosmarinsäure Synthase (RAS) verestert die mit Coenzym A aktivierten (Hydroxy-) Zimtsäuren mit den Produkten der HPPR. Da die bislang bekannten RAS, die aus zwei Coleus-Arten, Plectranthus fruticosus und Melissa officinalis kloniert werden konnten, lediglich 4-Hydroxyphenyllactat und 3,4-Dihydroxyphenyllactat jedoch weder Chinasäure noch Shikimisäure als Akzeptorsubstrate akzeptieren, gilt dieses Enzym als das möglicherweise einzige spezifische Enzym des Biosynthesewegs. Im Genom der Melisse konnte durch Southern Blotting nur eine RAS-Genkopie nachgewiesen werden

A Hormonal Signaling Pathway Influencing C. elegans Metabolism, Reproductive Development, and Life Span

AbstractDuring C. elegans development, animals must choose between reproductive growth or dauer diapause in response to sensory cues. Insulin/IGF-I and TGF-β signaling converge on the orphan nuclear receptor daf-12 to mediate this choice. Here we show that daf-9 acts downstream of these inputs but upstream of daf-12. daf-9 and daf-12 mutants have similar larval defects and modulate insulin/IGF-I and gonadal signals that regulate adult life span. daf-9 encodes a cytochrome P450 related to vertebrate steroidogenic hydroxylases, suggesting that it could metabolize a DAF-12 ligand. Sterols may be the daf-9 substrate and daf-12 ligand because cholesterol deprivation phenocopies mutant defects. Sensory neurons, hypodermis, and somatic gonadal cells expressing daf-9 identify potential endocrine tissues. Evidently, lipophilic hormones influence nematode metabolism, diapause, and life span

Evolution of substrate recognition sites (SRSs) in cytochromes P450 from Apiaceae exemplified by the CYP71AJ subfamily

Background Large proliferations of cytochrome P450 encoding genes resulting from gene duplications can be termed as ‘blooms’, providing genetic material for the genesis and evolution of biosynthetic pathways. Furanocoumarins are allelochemicals produced by many of the species in Apiaceaous plants belonging to the Apioideae subfamily of Apiaceae and have been described as being involved in the defence reaction against phytophageous insects.[br/] Results A bloom in the cytochromes P450 CYP71AJ subfamily has been identified, showing at least 2 clades and 6 subclades within the CYP71AJ subfamily. Two of the subclades were functionally assigned to the biosynthesis of furanocoumarins. Six substrate recognition sites (SRS1-6) important for the enzymatic conversion were investigated in the described cytochromes P450 and display significant variability within the CYP71AJ subfamily. Homology models underline a significant modification of the accession to the iron atom, which might explain the difference of the substrate specificity between the cytochromes P450 restricted to furanocoumarins as substrates and the orphan CYP71AJ.[br/] Conclusion Two subclades functionally assigned to the biosynthesis of furanocoumarins and four other subclades were identified and shown to be part of two distinct clades within the CYP71AJ subfamily. The subclades show significant variability within their substrate recognition sites between the clades, suggesting different biochemical functions and providing insights into the evolution of cytochrome P450 ‘blooms’ in response to environmental pressures

Transcriptome analysis of Thapsia laciniata rouy provides insights into terpenoid biosynthesis and diversity in apiaceae

Thapsia laciniata Rouy (Apiaceae) produces irregular and regular sesquiterpenoids with thapsane and guaiene carbon skeletons, as found in other Apiaceae species. A transcriptomic analysis utilizing Illumina next-generation sequencing enabled the identification of novel genes involved in the biosynthesis of terpenoids in Thapsia. From 66.78 million HQ paired-end reads obtained from T. laciniata roots, 64.58 million were assembled into 76,565 contigs (N50: 1261 bp). Seventeen contigs were annotated as terpene synthases and five of these were predicted to be sesquiterpene synthases. Of the 67 contigs annotated as cytochromes P450, 18 of these are part of the CYP71 clade that primarily performs hydroxylations of specialized metabolites. Three contigs annotated as aldehyde dehydrogenases grouped phylogenetically with the characterized ALDH1 from Artemisia annua and three contigs annotated as alcohol dehydrogenases grouped with the recently described ADH1 from A. annua. ALDH1 and ADH1 were characterized as part of the artemisinin biosynthesis. We have produced a comprehensive EST dataset for T. laciniata roots, which contains a large sample of the T. laciniata transcriptome. These transcriptome data provide the foundation for future research into the molecular basis for terpenoid biosynthesis in Thapsia and on the evolution of terpenoids in Apiaceae.Damian Paul Drew, Bjørn Dueholm, Corinna Weitzel, Ye Zhang, Christoph W. Sensen and Henrik Toft Simonse

Rosmarinsäure-Biosynthese in Suspensionskulturen von Melissa officinalis L.

Die an der Rosmarinsäure-Biosynthese beteiligten Enzyme konnten bereits in Zellkulturen von Coleus blumei und verschiedenen Lamiaceen und Boraginaceen identifiziert und charakterisiert werden. Dennoch ist bislang wenig über die Regulationsmechanismen des Biosynthesewegs auf genomischer Ebene bekannt. Diese Arbeit sollte durch genaue Untersuchung der Rosmarinsäure-Biosynthese in einer diploiden Melissa officinalis-Suspensionskultur die Grundlage für die Aufklärung regulatorischer Mechanismen legen. Zu diesem Zweck waren eine genaue Charakterisierung der Zellkultur und die Charakterisierung der an der Biosynthese beteiligten Enzyme sowohl im Proteinrohextrakt als auch nach Klonierung und heterologer Expression in E. coli erforderlich. Rosmarinsäure, Hauptbestandteil der sogenannten Labiatengerbstoffe, ist ein Ester aus Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure, der im Pflanzenreich weit verbreitet anzutreffen ist. Für die Pflanzen erfüllt er vermutlich die Rolle eines konstitutiv gebilde-ten Abwehrstoffes zum Schutz vor Fraßfeinden. Die Biosynthese geht von den beiden Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin aus. Diese werden nach enzymatischer Umwandlung zu 4-Cumaroyl-CoA und 4-Hydroxyphenyllactat durch die Rosmarinsäure Synthase, einer Acyltransferase aus der Familie der BAHD-Enzyme, miteinander vere-stert und das Reaktionsprodukt durch anschließende 3- und 3’-Hydroxylierung zu Rosmarinsäure umgesetzt. Suspensionskulturen der Melisse sind in der Lage in kurzen Kulturperioden in Abhängigkeit vom Saccharosegehalt des Mediums bezogen auf das Zelltrockengewicht bis zu 7 % Rosmarinsäure zu akkumulieren (in Medium mit 4 % Saccharose). Durch Zugabe von Methyljasmonat ist eine weitere Steigerung möglich. Die Umwandlung des L-Phenylalanins zum Hydroxyzimtsäure-CoA-Ester erfolgt durch die Enzyme des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels: Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL), Zimtsäure 4-Hydroxylase (C4H) und Hydroxyzimtsäure:CoA-Ligase (4CL). Zusätzlich zur detaillierten Charakterisierung der nativen Enzyme gelangen Klonierung und Charakterisierung je einer PAL- und 4CL-Isoform. Für beide Enzyme konnte durch Southern Blotting die Existenz zweier Genkopien nachgewiesen werden. mRNA-Expressionsprofile, die sowohl für die PAL als auch für die 4CL über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen in Medium mit 2 % Saccharose erstellt wurden, weisen auf eine mögliche Beteiligung der klonierten Isoformen an der Rosmarinsäure-Biosynthese hin. Mithilfe der zur Klonierung verwendeten Volllängenprimer war es außerdem möglich, die genomischen Sequenzen beider Enzyme aufzuklären. Die genomische Sequenz der PAL weist ein charakteristisches Intron auf, welches in den PAL-Sequenzen der An-giospermen in einer konservierten Position zu finden ist. Die genomische Sequenz der klonierten 4CL ist hingegen Intron-frei. Katalysiert durch die Tyrosin Aminotransferase (TAT) wird L-Tyrosin zunächst in 4-Hydroxyphenylpyruvat umgewandelt. Die im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen ermittelten kinetischen Parameter korrelieren gut mit den Werten die bereits zuvor für das Enzym in Pflanzen (Coleus blumei, Anchusa officinalis), Säugetieren (Ratte) oder Protozoen (Trypanosoma cruzi) bestimmt wurden. Mithilfe der RACE-PCR konnte eine cDNA-Teilsequenz aufgeklärt werden, die große Übereinstimmung mit anderen TAT-Sequenzen aufweist. Durch ein weiteres Enzym, die sogenannte Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) wird das 4-Hydroxyphenylpyruvat zum Lactat reduziert. Die in Coleus blumei-Proteinrohextrakten ermittelten Substratpräferenzen dieses Enzyms konnten für das native Enzym aus Melissa officinalis bestätigt werden. Auch im Proteinrohextrakt aus Melissen-Suspensionskulturen wurde für 4-Hydroxyphenylpyruvat ein niedrigerer apparenter Km-Wert als für 3,4-Dihydroxyphenyllactat (5 µmol/l respektive 28 µmol/l) und für NADPH ein niedrigerer Wert als für NADH ermittelt (58 µmol/l respektive 90 µmol/l). Noch ungeklärt ist die Frage, ob es sich bei der HPPR um ein spezifisches Enzym des Rosmarinsäure-Biosynthesewegs handelt oder ob die Reaktion durch ein Enzym der Photorespiration, die cytosolische Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPR), katalysiert wird. Die Rosmarinsäure Synthase (RAS) verestert die mit Coenzym A aktivierten (Hydroxy-) Zimtsäuren mit den Produkten der HPPR. Da die bislang bekannten RAS, die aus zwei Coleus-Arten, Plectranthus fruticosus und Melissa officinalis kloniert werden konnten, lediglich 4-Hydroxyphenyllactat und 3,4-Dihydroxyphenyllactat jedoch weder Chinasäure noch Shikimisäure als Akzeptorsubstrate akzeptieren, gilt dieses Enzym als das möglicherweise einzige spezifische Enzym des Biosynthesewegs. Im Genom der Melisse konnte durch Southern Blotting nur eine RAS-Genkopie nachgewiesen werden