Cross-Talk-Free Multi-Color STORM Imaging Using a Single Fluorophore

Multi-color stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) is routinely performed; however, the various approaches for achieving multiple colors have important caveats. Color cross-talk, limited availability of spectrally distinct fluorophores with optimal brightness and duty cycle, incompatibility of imaging buffers for different fluorophores, and chromatic aberrations impact the spatial resolution and ultimately the number of colors that can be achieved. We overcome these complexities and develop a simple approach for multi-color STORM imaging using a single fluorophore and sequential labelling. In addition, we present a simple and versatile method to locate the same region of interest on different days and even on different microscopes. In combination, these approaches enable cross-talk-free multi-color imaging of sub-cellular structures.Peer ReviewedPostprint (published version

Unravelling motor protein organization on lysosomal membranes with super-resolution microscopy

This thesis first develops new methods for high-throughput and multi-color super-resolution microscopy (Chapters 2 and 3). Subsequently, I apply these methods to study the organization of motor proteins on the lysosome membrane inside cells with the purpose of determining how intracellular transport can be regulated via motor-protein organization (Chapter 4). Chapter 1 is an Introduction to the state of the art for our knowledge in microtubule-based intracellular transport. Chapter 2 introduces the single molecule localization techniques that improve the spatial resolution of light microscopy. This chapter emphasizes the Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) technique, which I used to study the organization of microtubule based motor proteins around lysosomes as well as the fusion and fission of mitochondria. Chapter 3 describes the development of two new techniques: (i) the use of microfluidic devices to improve the throughput of correlative live-cell and super-resolution microscopy, thus allowing to observe rare events and (ii) sequential multi-color imaging that increases the number of colors that can be imaged with STORM. Chapter 4 focuses on the biological application of sequential multicolor imaging to study the 3D organization of dynein and kinesin on lysosomal membranes. Conclusions and Future Perspectives are provided in Chapter 5.El transporte intracelular es de vital importancia para mantener la organización subcelular. Fallos en el transporte intracelular pueden desembocar en diversas enfermedades, especialmente si el fallo tiene lugar en el sistema nervioso. Los actores principales involucrados en el transporte intracelular son el citoesqueleto de microtúbulos y las proteínas motoras. El citoesqueleto de microtúbulos conecta la región perinuclear a la periferia de la célula, actuando así como carriles para el transporte. Las proteínas motoras se desplazan a lo largo del citoesqueleto de microtúbulos para llevar cargas. Hay dos tipos de familias de proteínas motoras que desplazan cargas a lo largo de los microtúbulos polarizados: la superfamilia de las kinesinas se mueve hacia el extremo positivo del carril microtubular mientras que las dineínas se mueven hacia el extremo negativo del carril microtubular. Desde su descubrimiento en los años sesenta, las proteínas motoras han sido extensamente estudiadas usando métodos in vitro de una sola molécula, permitiéndonos entender las bases del transporte intracelular. No obstante, las proteínas motoras, sus carriles microtubulares y las vesículas que portan tienen tamaños comprendidos de decenas a centenas de nanómetros, por debajo del límite de difracción de la microscopía óptica. Así, el estudio del tráfico intracelular en el contexto celular ha sido desafiante. Mientras que los estudios in vitro son altamente valiosos para mejorar nuestra comprensión de cómo funcionan las proteínas motoras, no pueden capturar la complejidad total del ambiente intracelular. Por tanto, es muy importante desarrollar nuevos métodos para superar el desafío de estudiar el transporte intracelular en células intactas. En la última década, el desarrollo y la llegada de los métodos de microscopía de superresolución, ha supuesto una revolución en el campo de la microscopía óptica. Estos métodos han hecho posible visualizar estructuras subcelulares con resolución espacial nanométrica, rompiendo el límite de difracción. Esta tesis primero desarrolla nuevos métodos para microscopía de alto rendimiento y superresolución multicolor (Capítulos 2 y 3). Seguidamente, aplico estos métodos para estudiar dentro de las células la organización de las proteínas motoras en la membrana del lisosoma con el objetivo de determinar cómo el transporte intracelular puede estar regulado a través de la organización de las proteínas motoras (Capítulo 4). El Capítulo 1 es una introducción al estado de la técnica para nuestro conocimiento en el transporte intracelular basado en microtúbulos. El Capítulo 2 introduce las técnicas de localización de una sola molécula que mejoran la resolución espacial de la microscopía óptica. Este capítulo enfatiza sobre la técnica de Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM), que utilicé para estudiar la organización de las proteínas motoras interactuando con microtúbulos, encima de los lisosomas, así como la fusión y la fisión de las mitocondrias. El Capítulo 3 describe el desarrollo de dos nuevas técnicas: (i) el uso de dispositivos microfluídicos para mejorar el rendimiento de la tecnica de correlacion entre celulas vivas y la microscopía de superresolución permitiendo observar evento raros y (ii) imágenes secuenciales multicolor que incrementan el número de colores que pueden ser fotografiados con STORM. El Capítulo 4 se centra en la aplicación biológica de las imágenes secuenciales multicolor para estudiar la organización tridimensional de la dineína y kinesina en la membrana lisosomática. Las conclusiones y perspectivas de futuro se presentan en el Capítulo 5.Postprint (published version

Evidence of electron-irradiation activated creep in amorphous olivine at room temperature

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Multigrid sequential data assimilation for the large-eddy simulation of a massively separated bluff-body flow

The potential for data-driven applications to scale-resolving simulations of turbulent flows is assessed herein. Multigrid sequential data assimilation algorithms have been used to calibrate solvers for Large Eddy Simulation for the analysis of the high-Reynolds-number flow around a rectangular cylinder of aspect ratio 5:1. This test case has been chosen because of a number of physical complexities which elude accurate representation using reduced-order numerical simulation. The results for the statistical moments of the velocity and pressure flow field show that the data-driven techniques employed, which are based on the Ensemble Kalman Filter, are able to significantly improve the predictive features of the solver for reduced grid resolution. In addition, it was observed that, despite the sparse and asymmetric distribution of observation in the data-driven process, the data augmented results exhibit perfectly symmetric statistics and a significantly improved accuracy also far from the sensor location

Unravelling motor protein organization on lysosomal membranes with super-resolution microscopy

This thesis first develops new methods for high-throughput and multi-color super-resolution microscopy (Chapters 2 and 3). Subsequently, I apply these methods to study the organization of motor proteins on the lysosome membrane inside cells with the purpose of determining how intracellular transport can be regulated via motor-protein organization (Chapter 4). Chapter 1 is an Introduction to the state of the art for our knowledge in microtubule-based intracellular transport. Chapter 2 introduces the single molecule localization techniques that improve the spatial resolution of light microscopy. This chapter emphasizes the Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) technique, which I used to study the organization of microtubule based motor proteins around lysosomes as well as the fusion and fission of mitochondria. Chapter 3 describes the development of two new techniques: (i) the use of microfluidic devices to improve the throughput of correlative live-cell and super-resolution microscopy, thus allowing to observe rare events and (ii) sequential multi-color imaging that increases the number of colors that can be imaged with STORM. Chapter 4 focuses on the biological application of sequential multicolor imaging to study the 3D organization of dynein and kinesin on lysosomal membranes. Conclusions and Future Perspectives are provided in Chapter 5.El transporte intracelular es de vital importancia para mantener la organización subcelular. Fallos en el transporte intracelular pueden desembocar en diversas enfermedades, especialmente si el fallo tiene lugar en el sistema nervioso. Los actores principales involucrados en el transporte intracelular son el citoesqueleto de microtúbulos y las proteínas motoras. El citoesqueleto de microtúbulos conecta la región perinuclear a la periferia de la célula, actuando así como carriles para el transporte. Las proteínas motoras se desplazan a lo largo del citoesqueleto de microtúbulos para llevar cargas. Hay dos tipos de familias de proteínas motoras que desplazan cargas a lo largo de los microtúbulos polarizados: la superfamilia de las kinesinas se mueve hacia el extremo positivo del carril microtubular mientras que las dineínas se mueven hacia el extremo negativo del carril microtubular. Desde su descubrimiento en los años sesenta, las proteínas motoras han sido extensamente estudiadas usando métodos in vitro de una sola molécula, permitiéndonos entender las bases del transporte intracelular. No obstante, las proteínas motoras, sus carriles microtubulares y las vesículas que portan tienen tamaños comprendidos de decenas a centenas de nanómetros, por debajo del límite de difracción de la microscopía óptica. Así, el estudio del tráfico intracelular en el contexto celular ha sido desafiante. Mientras que los estudios in vitro son altamente valiosos para mejorar nuestra comprensión de cómo funcionan las proteínas motoras, no pueden capturar la complejidad total del ambiente intracelular. Por tanto, es muy importante desarrollar nuevos métodos para superar el desafío de estudiar el transporte intracelular en células intactas. En la última década, el desarrollo y la llegada de los métodos de microscopía de superresolución, ha supuesto una revolución en el campo de la microscopía óptica. Estos métodos han hecho posible visualizar estructuras subcelulares con resolución espacial nanométrica, rompiendo el límite de difracción. Esta tesis primero desarrolla nuevos métodos para microscopía de alto rendimiento y superresolución multicolor (Capítulos 2 y 3). Seguidamente, aplico estos métodos para estudiar dentro de las células la organización de las proteínas motoras en la membrana del lisosoma con el objetivo de determinar cómo el transporte intracelular puede estar regulado a través de la organización de las proteínas motoras (Capítulo 4). El Capítulo 1 es una introducción al estado de la técnica para nuestro conocimiento en el transporte intracelular basado en microtúbulos. El Capítulo 2 introduce las técnicas de localización de una sola molécula que mejoran la resolución espacial de la microscopía óptica. Este capítulo enfatiza sobre la técnica de Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM), que utilicé para estudiar la organización de las proteínas motoras interactuando con microtúbulos, encima de los lisosomas, así como la fusión y la fisión de las mitocondrias. El Capítulo 3 describe el desarrollo de dos nuevas técnicas: (i) el uso de dispositivos microfluídicos para mejorar el rendimiento de la tecnica de correlacion entre celulas vivas y la microscopía de superresolución permitiendo observar evento raros y (ii) imágenes secuenciales multicolor que incrementan el número de colores que pueden ser fotografiados con STORM. El Capítulo 4 se centra en la aplicación biológica de las imágenes secuenciales multicolor para estudiar la organización tridimensional de la dineína y kinesina en la membrana lisosomática. Las conclusiones y perspectivas de futuro se presentan en el Capítulo 5

Une approche culturelle de la résilience urbaine sur le territoire de Mantes-la-Jolie

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