Impact of RANK overexpression on mammary stem cell fate, alveolar cell differentiation and tumorigenesis

Esta tesis doctoral se ha centrado en el paper de la vía de RANK y RANKL, que ha emergido durante los últimos años como una vía crucial en el desarrollo de la glándula mamaria y cáncer de mama. La deleción génica de RANK o su sobreexpresión en la glándula mamaria dirigida por el promotor viral MMTV inhibe la diferenciación alveolar durante la gestación y la fase de lactancia. Se ha demostrado que RANKL actúa como mediador de los efectos proliferativos de la progesterona en la glándula mamaria. Además, la inhibición farmacológica de RANKL previene la formación de tumores de mama en ratones silvestres (wild-type, WT) tratados con un protocolo carcinogénico que incluye el mutágeno dimethylbenz(a)antraceno (DMBA), y un análogo de progesterona (Medroxiprogesterona). En primer lugar, nos planteamos elucidar de qué manera la señalización a través de RANK regula la diferenciación mamária. Demostramos que RANK regula diferentes poblaciones en la jerarquía epitelial mamaria. De echo, la activación constitutiva de RANK en la glándula mamaria no solo expande las células madre mamarias y los progenitores intermedios, sino que también induce una reducción de los progenitores alveolares e inhibe su diferenciación en células alveolares productoras de leche mediante la inhibición de la vía de señalización de receptor de prolactina/STAT5/Elf5. Además, demostramos que la vía de señalización de NF-kB, que se activa debajo de RANK, regula el balance entre el enriquecimiento y la diferenciación de las células epiteliales de mama, aunque NF-kB no es directamente responsable de las alteraciones celulares observadas en las glándulas mamarias de ratones que sobreexpresan RANK. La história reproductiva y la edad son dos factores que promueven positivamente la tumorigenesis en mama, y nosotros hemos descrito que altos niveles de RANK en la glándula mamaria promueve la formación de tumores mamarios espontáneos tras múltiples gestaciones. También hemos caracterizado el impacto de la sobreexpresión de RANK en dos modelos de tumorigenesis espontánea y metastasis que son negativos para receptores hormonales: NEU y PYMT. Demostramos que la señalización a través de RANK juega un papel complejo en la tumorigenesis mamaria, afectando la iniciación y/o agresividad tumoral en estos modelos de ratón con tumorigenesis inducida por un oncogén. Como descubrimos que la vía de señalización de RANK regula el linaje de células epiteliales mamarias, investigamos si esta vía de señalización juega un papel en la regulación de las células madre cancerígenas. Demostramos que la sobreexpresión de RANK expande la población de células madre cancerígenas en modelos murinos que sobreexpresan PYMT, mientras que el bloqueo de la señalización de RANK mediante RANK-Fc no solo reduce ésta población de células madre, sino que también induce una diferenciación lactogénica de las células tumorales, resultando en una disminución en la formación de tumores y la metástasis. Además, la deleción génica de RANK en modelos MMTV-PYMT confirmó que RANK es importante para la formación tumoral, y que media el potencial metastático de las células tumorales mamarias. De esta forma, nuestros resultados suportan que el bloqueo de RANK puede ser una nueva diana terapéutica para tratar tumores mamarios positivos y negativos para receptores hormonales.Breast cancer is the second most common cancer worldwide, the fifth most common cause of cancer death, and the leading cause of cancer death in women. Distinct biological features and clinical behaviors turn cancer into a very heterogeneous disease, and although significant advances in the fight against breast cancer have been achieved during the last decades, a more profound understanding of their biology is still needed. This thesis project is focused in RANK/RANKL signaling pathway, as during the last decade it has emerged as a key pathway in mammary gland development and tumorigenesis. RANK deletion or overexpression under the MMTV promoter disrupts mammary gland differentiation during pregnancy and lactation (Fata et al. 2000; Gonzalez-Suarez et al. 2007). It has been demonstrated that RANKL is downstream of progesterone and mediates its proliferative effects in the mammary gland (Beleut et al. 2010). Moreover, pharmacological inhibition of RANKL signaling prevents mammary tumor formation in WT mice under a carcinogenic treatment that includes a mutagen (dimethylbenz(a)anthracene, DMBA) and an analogous of progesterone (medroxiprogesterone, MPA) (Gonzalez-Suarez et al. 2010). First, we aimed to elucidate how RANK signaling is regulating mammary gland differentiation. We demonstrated that RANK regulates different populations in mammary epithelial hierarchy. Indeed, constitutive activation of RANK in the mammary gland not only expands mammary stem cells (MaSC) and intermediate progenitors, but also reduced alveolar progenitors and impairs its differentiation into alveolar milk-producing cells through downregulation of the PrlR/STAT5/Elf5 signaling pathway. In addition we demonstrated that NF-KB, a signaling pathway activated downstream of RANK, regulates the balance between MEC self-renewal and differentiation. Reproductive story and age have been linked to mammary tumorigenesis, and we found that increased levels of RANK in the mammary gland promote spontaneous tumor formation in mice under multiple gestations. We have also addressed the impact of RANK overexpression in two mouse models of spontaneous and metastatic hormone receptor negative breast cancer: MMTV-NEU and MMTV-PYMT. We demonstrated that RANK signaling plays a complex role in mammary tumorigenesis, affecting tumor initiation and/or aggressiveness in those oncogene-driven mouse models. As we discovered that RANK signaling regulates mammary stem cell fate, we investigated whether this signaling pathway plays a role in the regulation of the cancer stem cell population. We demonstrated that RANK overexpression expands the cancer stem cell pool in PYMT-driven tumors, whereas RANK signaling blockage with RANK-Fc not only reduced this cancer stem cell population, but also induced tumor cell differentiation, resulting in decreased tumor recurrence and metastasis. Genetic deletion of RANK in MMTV-PYMT mice confirmed that RANK is important in tumor formation and mediates the metastatic potential of mammary tumor cells. Altogether, our results supported that blocking RANKL could be a novel therapeutic therapy to treat both human hormone receptor positive and negative breast tumor subtypes

Stem cell-like transcriptional reprogramming mediates metastatic resistance to mTOR inhibition

Inhibitors of the mechanistic target of rapamycin (mTOR) are currently used to treat advanced metastatic breast cancer. However, whether an aggressive phenotype is sustained through adaptation or resistance to mTOR inhibition remains unknown. Here, complementary studies in human tumors, cancer models and cell lines reveal transcriptional reprogramming that supports metastasis in response to mTOR inhibition. This cancer feature is driven by EVI1 and SOX9. EVI1 functionally cooperates with and positively regulates SOX9, and promotes the transcriptional upregulation of key mTOR pathway components (REHB and RAPTOR) and of lung metastasis mediators (FSCN1 and SPARC). The expression of EVI1 and SOX9 is associated with stem cell-like and metastasis signatures, and their depletion impairs the metastatic potential of breast cancer cells. These results establish the mechanistic link between resistance to mTOR inhibition and cancer metastatic potential, thus enhancing our understanding of mTOR targeting failure