Guanidino-funktionalisierte Aromaten mit Redoxabhängiger Fluoreszenz

Guanidino-funktionalisierte Aromaten (GFA) sind starke Elektronendonoren und besitzen eine hohe Lewis- und Brønsted-Basizität. Sie sind daher als Reagenzien für Protonengekoppelte Elektronentransfer-Reaktionen (PCET-Reaktionen) sowie als redoxaktive Liganden geeignet. Diese Dissertation beschreibt die erstmalige Substitution der aromatischen Protonen eines Tetrakisguanidino-GFA mittels einer C−C-Bindungsknüpfung. Durch Einführung von zwei paraständigen Ethinylgruppen zusätzlich zu vier elektronenschiebenden Guanidinogruppen an den aromatischen Benzolring entsteht ein Ligandensystem mit redoxabhängiger Fluoreszenz. Während die reduzierten Spezies in allen Protonierungsstufen fluoreszieren, führt die zweifache Oxidation des GFA zur Dearomatisierung und einer vollständigen Fluoreszenzlöschung des Systems. Die redoxabhängige Fluoreszenz bildet zusammen mit der Brønsted-Basizität die Grundlage für den Einsatz der vierfach guanidino-funktionalisierten Diethinylbenzole als Fluoreszenzsonden in PCET Reaktionen. Ausgehend von der zweifach oxidierten, fluoreszenzgelöschten Spezies können verschiedene organische Substrate oxidiert werden. Hierbei werden zwei Elektronen und zwei Protonen vom Substrat auf den GFA übertragen, der in die fluoreszenzaktive, reduzierte und zweifach protonierte Form überführt wird. Der Reaktionsfortschritt wird durch die Änderung des Fluoreszenzsignals verfolgt und auf diese Weise kinetische Daten über PCET-Reaktionen erhalten. Durch Verwendung hoher Substratüberschüsse und Anwendung der Isoliermethode werden Rückschlüsse auf die Reaktionsordnung der PCET-Reaktionen gewonnen. Für die betrachteten Reaktionen sprechen die experimentellen Daten für einen konzertierten PCET-Mechanismus. Das entwickelte System ist eines der wenigen Beispiele für den Einsatz einer Fluoreszenzsonde mit redoxabhängiger Fluoreszenz in PCET-Reaktionen. Die vierfach guanidino-funktionalisierten Diethinylbenzole sind zudem in der Lage zweikernige Koordinationsverbindungen mit verschiedenen Cu(I)- und Cu(II)-Salzen zu bilden. Die Komplexierung führt zu einer vollständigen Fluoreszenzlöschung des Systems, was im Einklang mit früheren Ergebnissen mit fluoreszierenden Guanidinliganden steht. In den synthetisierten Komplexen liegt der GFA stets in seiner reduzierten Form vor, da eine Oxidation des Liganden, im Gegensatz zu anderen redoxaktiven GFA, zur Dekomplexierung führt. Die Liganden mit terminalen Alkingruppen bieten zudem die Möglichkeit weiterer Funktionalisierung, durch die sich das GFA-Konzept erweitern lässt. Neben der Möglichkeit von C−C-Kupplungen an den terminalen Alkinen, wofür erste experimentelle Ergebnisse vorgestellt werden, ergibt die Umsetzung mit Lewis-Säuren Moleküle mit ungewöhnlichen Eigenschaften. Die Reaktion mit sterisch anspruchsvollen Lewis-Säuren wie Tris(pentafluorophenyl)boran (BCF) führen zur Bildung zwitterionischer Addukte, bei denen die Lewis-Säure an die terminalen Alkine bindet und die AlkinProtonen auf die basischen Guanidinogruppen übertragen werden. Dies ist ein Spezialfall der Aktivierung eines terminalen Alkins durch ein frustriertes Lewis-Paar, bei dem Alkin und Base im selben Molekül vorliegen. Durch Addition der Lewis-Säuren können die optischen Eigenschaften wie Absorptions- und Emissionsbanden dieser GFA gesteuert werden. Für das Addukt des Tetrakisguanidino-funktionalisierten Diethinylbenzol mit BCF wurde zudem ein deutlicher Anstieg der Elektronendonorstärke erhalten. Die Lewis-Säure Addukte liegen in reduzierter und zweifach protonierter Form neutral vor statt, wie bei GFA üblich, zweifach positiv geladen. Dies resultiert in dem niedrigsten Redoxpotential aller bisher bekannten Tetrakisguanidino-funktionalisierten Aromaten

Experimenta de excretione calcariae et magnesiae : dissertatio inauguralis

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Kontingenzbewältigung in Russland angesichts der Bedrohung St. Petersburgs 1812

Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers (De Gruyter) frei zugänglich.Im Sommer 1812 sah das Russische Reich einer militärischen wie finanziellen Katastrophe entgegen. Noch bevor die napoleonische Grande Armée russisches Territorium betrat, hatte sich das Russische Imperium, erschüttert durch vergangene Kriege, in einer tiefen Schuldenkrise befunden. Mit dem Vormarsch der französischen Truppen geriet das Zarenreich zudem an den Rand der militärischen Niederlage. Russland stand einer doppelten Krise gegenüber – dem drohenden Staatsbankrott wie der erwarteten Eroberung seiner Hauptstadt. Denn anders als die Meistererzählung jüngerer Darstellungen nahelegt, gingen Zar Alexander I. und seine Berater davon aus, Napoleon werde St. Petersburg – und nicht etwa Moskau – angreifen und erobern können. Wie bewältige Zar Alexander I. die Kontingenz der Krise? Der Ungewissheit über den Fortgang des Krieges und der Unsicherheit seiner finanziellen Verteidigungsressourcen, zweier ineinander verschränkter Bedrohungen, begegnete der Zar durch aktives Zukunftshandeln: Binnen weniger Tage verordnete er, Schätze und Geldreserven aus St. Petersburg zu evakuieren und Assignaten in großer Stückzahl zur Kriegsfinanzierung zu drucken. Die Strategien finanzpolitischer und evakuatorischer Prävention lassen erkennen, wie der Zar seinen Staat verstand, wie es seinen Beamten gelang, die Verteidigungs- und Regierungsfähigkeit des Reiches zu wahren und welchen Anteil die zivile Verwaltung daran hatte, die Niederlage Russlands 1812 abzuwenden.Peer Reviewe

Glycine N-methyltransferases: A comparison of the crystal structures and kinetic properties of recombinant human, mouse and rat enzymes

Glycine N-methyltransferases (GNMTs) from three mammalian sources were compared with respect to their crystal structures and kinetic parameters. The crystal structure for the rat enzyme was published previously. Human and mouse GNMT were expressed in Escherichia coli in order to determine their crystal structures. Mouse GNMT was crystallized in two crystal forms, a monoclinic form and a tetragonal form. Comparison of the three structures reveals subtle differences, which may relate to the different kinetic properties of the enzymes. The flexible character of several loops surrounding the active site, along with an analysis of the active site boundaries, indicates that the observed conformations of human and mouse GNMTs are more open than that of the rat enzyme. There is an increase in kcat when going from rat to mouse to human, suggesting a correlation with the increased flexibility of some structural elements of the respective enzymes. © 2004 Wiley-Liss, Inc

Folate in demethylation: The crystal structure of the rat dimethylglycine dehydrogenase complexed with tetrahydrofolate

Dimethylglycine dehydrogenase (DMGDH) is a mammalian mitochondrial enzyme which plays an important role in the utilization of methyl groups derived from choline. DMGDH is a flavin containing enzyme which catalyzes the oxidative demethylation of dimethylglycine in vitro with the formation of sarcosine (N-methylglycine), hydrogen peroxide and formaldehyde. DMGDH binds tetrahydrofolate (THF) in vivo, which serves as an acceptor of formaldehyde and in the cell the product of the reaction is 5,10-methylenetetrahydrofolate instead of formaldehyde. To gain insight into the mechanism of the reaction we solved the crystal structures of the recombinant mature and precursor forms of rat DMGDH and DMGDH-THF complexes. Both forms of DMGDH reveal similar kinetic parameters and have the same tertiary structure fold with two domains formed by N- and C-terminal halves of the protein. The active center is located in the N-terminal domain while the THF binding site is located in the C-terminal domain about 40 Å from the isoalloxazine ring of FAD. The folate binding site is connected with the enzyme active center via an intramolecular channel. This suggests the possible transfer of the intermediate imine of dimethylglycine from the active center to the bound THF where they could react producing a 5,10- methylenetetrahydrofolate. Based on the homology of the rat and human DMGDH the structural basis for the mechanism of inactivation of the human DMGDH by naturally occurring His109Arg mutation is proposed. ©2014 Elsevier Inc. All rights reserved

Differences in folate-protein interactions result in differing inhibition of native rat liver and recombinant glycine N-methyltransferase by 5-methyltetrahydrofolate

Glycine N-methyltransferase (GNMT) is a key regulatory enzyme in methyl group metabolism. In mammalian liver it reduces S-adenosylmethionine levels by using it to methylate glycine, producing N-methylglycine (sarcosine) and S-adenosylhomocysteine. GNMT is inhibited by binding two molecules of 5-methyltetrahydrofolate (mono- or polyglutamate forms) per tetramer of the active enzyme. Inhibition is sensitive to the status of the N-terminal valine of GNMT and to polyglutamation of the folate inhibitor. It is inhibited by pentaglutamate form more efficiently compared to monoglutamate form. The native rat liver GNMT contains an acetylated N-terminal valine and is inhibited much more efficiently compared to the recombinant protein expressed in E. coli where the N-terminus is not acetylated. In this work we used a protein crystallography approach to evaluate the structural basis for these differences. We show that in the folate-GNMT complexes with the native enzyme, two folate molecules establish three and four hydrogen bonds with the protein. In the folate-recombinant GNMT complex only one hydrogen bond is established. This difference results in more effective inhibition by folate of the native liver GNMT activity compared to the recombinant enzyme. © 2011 Elsevier B.V. All rights reserved

Evaluation of the appropriate time period between sampling and analyzing for automated urinalysis

Introduction: Preanalytical specifications for urinalysis must be strictly adhered to avoid false interpretations. Aim of the present study is to examine whether the preanalytical factor ‘time point of analysis’ significantly influences stability of urine samples for urine particle and dipstick analysis. Materials and methods: In 321 pathological spontaneous urine samples, urine dipstick (Urisys™2400, Combur-10-Test™strips, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) and particle analysis (UF-1000 i™, Sysmex, Norderstedt, Germany) were performed within 90 min, 120 min and 240 min after urine collection. Results: For urine particle analysis, a significant increase in conductivity (120 vs. 90 min: P < 0.001, 240 vs. 90 min: P < 0.001) and a significant decrease in WBC (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), RBC (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), casts (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001) and epithelial cells (120 vs. 90 min P = 0.610, 240 vs. 90 min P = 0.041) were found. There were no significant changes for bacteria. Regarding urine dipstick analysis, misclassification rates between measurements were significant for pH (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), leukocytes (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), nitrite (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), protein (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P<0.001), ketone (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), blood (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001), specific gravity (120 vs. 90 min P < 0.001, 240 vs. 90 min P < 0.001) and urobilinogen (120 vs. 90 min, P = 0.031). Misclassification rates were not significant for glucose and bilirubin. Conclusion: Most parameters critically depend on the time window between sampling and analysis. Our study stresses the importance of adherence to early time points in urinalysis (within 90 min)

5-Methyltetrahydrofolate is bound in intersubunit areas of rat liver folate-binding protein glycine N-methyltransferase

Glycine N-methyltransferase (GNMT) is a key regulatory enzyme in methyl group metabolism. It is abundant in the liver, where it uses excess S-adenosylmethionine (AdoMet) to methylate glycine to N-methylglycine (sarcosine) and produces S-adenosylhomocysteine (AdoHcy), thereby controlling the methylating potential of the cell. GNMT also links utilization of preformed methyl groups, in the form of methionine, to their de novo synthesis, because it is inhibited by a specific form of folate, 5-methyltetrahydrofolate. Although the structure of the enzyme has been elucidated by x-ray crystallography of the apoenzyme and in the presence of the substrate, the location of the folate inhibitor in the tetrameric structure has not been identified. We report here for the first time the crystal structure of rat GNMT complexed with 5-methyltetrahydrofolate. In the GNMT-folate complex, two folate binding sites were located in the intersubunit areas of the tetramer. Each folate binding site is formed primarily by two 1-7 N-terminal regions of one pair of subunits and two 205-218 regions of the other pair of subunits. Both the pteridine and p-aminobenzoyl rings are located in the hydrophobic cavities formed by Tyr 5, Leu207, and Met215 residues of all subunits. Binding experiments in solution also confirm that one GNMT tetramer binds two folate molecules. For the enzymatic reaction to take place, the N-terminal fragments of GNMTmust have a significant degree of conformational freedom to provide access to the active sites. The presence of the folate in this position provides a mechanism for its inhibition