Cwc24p Is a General Saccharomyces cerevisiae Splicing Factor Required for the Stable U2 snRNP Binding to Primary Transcripts

Splicing of primary transcripts is an essential process for the control of gene expression. Specific conserved sequences in premature transcripts are important to recruit the spliceosome machinery. The Saccharomyces cerevisiae catalytic spliceosome is composed of about 60 proteins and 5 snRNAs (U1, U2, U4/U6 and U5). Among these proteins, there are core components and regulatory factors, which might stabilize or facilitate splicing of specific substrates. Assembly of a catalytic complex depends on the dynamics of interactions between these proteins and RNAs. Cwc24p is an essential S. cerevisiae protein, originally identified as a component of the NTC complex, and later shown to affect splicing in vivo. In this work, we show that Cwc24p also affects splicing in vitro. We show that Cwc24p is important for the U2 snRNP binding to primary transcripts, co-migrates with spliceosomes, and that it interacts with Brr2p. Additionally, we show that Cwc24p is important for the stable binding of Prp19p to the spliceosome. We propose a model in which Cwc24p is required for stabilizing the U2 association with primary transcripts, and therefore, especially important for splicing of RNAs containing non- consensus branchpoint sequences.Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo - FAPESP [09/52826-4]Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP)FAPESP fellowship [09/52176-0]FAPESP fellowshi

Projeto de extensão Entrando no Clima: Pedagogia crítica para a alfabetização em climatologia e mudanças climáticas

Este trabalho apresenta o desenvolvimento e os resultados do projeto “Entrando no Clima”, realizado através do Programa de Extensão Universitária, Ciência e Artes nas Férias (CAF), desenvolvido entre os dias 06 e 31 de janeiro de 2020. O projeto procura ligar a Universidade ao meio onde ela está inserida através do desenvolvimento de materiais e atividades pedagógicas para a comunicação do conhecimento científico produzido sobre climatologia e mudanças climáticas. Para isso foram desenvolvidas três oficinas direcionadas a alunos do Ensino Médio que participaram do CAF 2020. A referência teórico-metodológica foi a pedagogia crítica de Paulo Freire, com o uso de duas diferentes abordagens para desenvolver a práxis: o diálogo e a problematização. A primeira oficina, composta por apresentações do Globo 3D e Estação Meteorológica, explorou os elementos e fatores geográficos do clima e serviram como aporte teórico para a segunda oficina, a dinâmica “Clima em jogo”. A terceira oficina foi desenvolvida pela construção de um folder para trabalhar conceitos de mudanças climáticas e climatologia numa perspectiva social, cultural e ambiental. Ao todo, 178 alunos participaram das oficinas que foram realizadas às quartas-feiras do mês de janeiro, entre às nove horas e meio-dia. Como resultado, o projeto “Entrando no Clima” foi avaliado por 84 alunos, 45,2% deles relataram a atividade como “excelente” ou “muito interessante”, 26,6% como interessante e 13,3% como pouco interessante. Nesse sentido, o programa de extensão “Entrando no Clima” promoveu o conhecimento e a ampliação dos saberes sobre climatologia aos alunos participantes do CAF 2020. Palavras-chave: Paulo Freire; Construtivismo; Diálogo Extension project Entering the Climate: Critical pedagogy for literacy in climatology and climate change Abstract: This work presents the development and the results of the “Entrando no Clima” project, carried out through the University Extension Program, Science and Arts on Vacation (CAF), developed between January 6th and 31st, 2020. This program aims to connect the University to the surrounding environment by building materials and pedagogical activities for communicating scientific knowledge about climatology and climate change. Therefore, we developed three workshops for high school students who attended CAF 2020. The theoretical-methodological reference was Paulo Freire's critical pedagogy, using two distinct approaches to develop praxis: dialogue and problematization. The first workshop, consisting of presentations of the 3D Globe and Meteorological Station, explored elements and geographic factors of Climate and served as theoretical support for the second workshop, the “Climate at stake” dynamic. The third workshop was developed by building a folder to work on concepts of climate change and Climatology from a social, cultural, and environmental perspective. Overall, 178 students attended the workshops on Wednesdays, in January, between nine a.m. and noon. As a result, 84 students evaluated the “Entrando no Clima” project, of which 45,2% reported the activity as excellent or very interesting, 26,6% as interesting, and 13,3% as not very interesting. In this sense, the extension program “Entrando no Clima” promoted knowledge and expansion of knowledge about Climatology to the students participating in CAF 2020. Keywords: Paulo Freire; Constructivism; Dialogu

Functional and structural analysis of Nip7p, a conserved protein involved in ribosome biogenesis

Orientador: Nilson Ivo Tonin ZanchinTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A síntese de ribossomos é um processo conservado em eucariotos e se inicia com a transcrição dos rRNAs no nucléolo. Mais de 170 fatores atuam de forma transitória no processamento dos precursores para gerar os rRNAs maduros que formarão as subunidades ribossomais no citoplasma. Entre as proteínas envolvidas na síntese de ribossomos está a Nip7p, uma proteína nucleolar de 21 kDa associada ao complexo pré-60S em Saccharomyces cerevisiae. Nip7p é conservada e possui ortólogas em eucariotos e em Archaea. A análise da seqüência primária revela a presença de um domínio conservado na região C-terminal, denominado PUA, encontrado em diversas proteínas associadas a modificações no RNA. Neste trabalho, foram realizadas análises estruturais e funcionais com o objetivo de investigar a função molecular da proteína Nip7 no processamento e modificação do rRNA. A estrutura tri-dimensional de PaNip7, ortóloga de Nip7p em Pyrococcus abyssi foi resolvida por difração de raios-X até 1,8Å de resolução, utilizando o método SIRAS. Comparação estrutural seguida por ensaios in vitro confirmaram o envolvimento do domínio PUA na interação com RNA. Além disso, tanto Nip7p como suas ortólogas PaNip7 e HsNip7 interagem com seqüências ricas em uridina, indicando que atuam de forma semelhante no processamento do rRNA. Essa preferência por uridina pode ainda explicar a afinidade da proteína Nip7p de S. cerevisiae pelo RNA da região ITS2, conforme observado em ensaios de interação utilizando UV-crosslinking. De fato, uma análise funcional realizada por primer extension comprovou que ocorre um bloqueio no processamento da região espaçadora ITS2 na ausência de Nip7p. Nip7p interage com várias proteínas do complexo pré-60S, entre as quais Nop8p e Nop53p, ambas associadas ao processamento do pré-27S. Embora os ensaios de co-purificação tenham confirmado a interação com as proteínas do complexo H/ACA box, deficiência em Nip7p não afeta a pseudo-uridinilação do rRNA. O duplo-híbrido realizado com a ortóloga humana de Nip7p, HsNip7, revelou interações com FTSJ3 e com a proteína SUMO-2. A interação direta de HsNip7 com estas proteínas foi confirmada por ensaios in vitro. HsNip7 e FTSJ3 colocalizaram na região nucleolar de células HEK293. FTSJ3 é uma proteína não caracterizada que possui o domínio FtsJ, descrito inicialmente para rRNA metiltransferases de procariotos. Além disso, FTSJ3 apresenta similaridade de sequência à proteína Spb1p de levedura, cuja função na metilação do rRNA 25S na posição Gm2922 já foi estabelecida. Embora a Nip7p não interaja com a Spb1p, estes dados indicam que FTSJ3 deve ser a ortóloga humana da Spb1p. As proteínas SUMO estão envolvidas na modificação pós-traducional (sumoylation) que regula a localização subcelular de proteínas. Em levedura, a provável ortóloga de SUMO, Smt3p, foi descrita na partícula pré-60S, portanto a interação HsNip7-SUMO-2 pode ser específica. Estes dados sugerem que as proteínas atuem no mesmo complexo da formação da subunidade 60S também em células humanasAbstract: Ribosome biogenesis is conserved throughout eukaryotes and takes place in the nucleolus, a specialized nuclear compartment where the rRNA precursors are transcribed. More than 170 trans-acting factors coordinately interact to generate the mature rRNAs. Among the proteins identified in the pre-60S particle in Saccharomyces cerevisiae is Nip7p. Highly conserved Nip7p orthologues are found in all eukaryotes and Archaea. The analysis of Nip7p sequence reveals a conserved C-terminal domain named PUA, also found in a number of RNA-interacting proteins. In this work, we performed structural and functional analysis to investigate Nip7p molecular role on rRNA processing and modification. The structure of Pyrococcus abyssi Nip7p ortholog, PaNip7, was solved using X-ray diffraction data to 1,8Å resolution. Structural analysis followed by in vitro assays confirmed the involvement of PUA domain in RNA interaction. S. cerevisiae Nip7p and its archaeal and human counterparts show preference for binding uridine-rich sequences, indicating conserved functional features among the orthologues. The preference for uridine can explain the higher affinity of S. cerevisiae Nip7p for ITS2 sequence, as observed by UV-crosslinking assays. Consistently, functional analysis revealed pre-rRNA processing in the ITS2 region is seriously impaired. Yeast two-hybrid analysis confirmed by pull down assays revealed Nip7p interacts with Nop8p and Nop53p, two nucleolar proteins involved in pre-27S processing and components of pre-60S particle. Although yeast two-hybrid and pull down assays indicated that Nip7p interacts with H/ACA box core proteins, pseudouridylation is not affected under conditions of Nip7p depletion. In addition, yeast two-hybrid analysis confirmed by GST-pull down revealed HsNip7 interaction with FTSJ3 and SUMO-2. Both HsNip7 and FTSJ3 showed nucleolar subcellular localization in HEK293 cells. FTSJ3 is an uncharacterized protein containing the FtsJ domain, initially described in prokaryotic rRNA methyl-transferases. FTSJ3 shows sequence similarity to yeast Spb1p, an rRNA methyl-transferase involved in methylation of Gm2922, indicating that FTSJ3 may be the human orthologue of Spb1p. Sumoylation is a post-transcriptional covalent modification involved in regulation of protein subcellular localization. Putative yeast orthologues of SUMO, such as Smt3p, have been described in the pre-60S ribosomal particle, suggesting that SUMO-2 might play a specific role in 60S subunit biogenesisDoutoradoGenetica Animal e EvoluçãoDoutor em Genetica e Biologia Molecula

Expressão de genes de Xylella fastidiosa sob diferentes condições de crescimento

Orientador: Yoko Bomura RosatoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaMestrad

Protein disulfide isomerase-mediated transcriptional upregulation of Nox1 contributes to vascular dysfunction in hypertension

Nox1 signaling is a causal key element in arterial hypertension. Recently, we identified protein disulfide isomerase A1 (PDI) as a novel regulatory protein that regulates Nox1 signaling in VSMCs. Spontaneously hypertensive rats (SHR) have increased levels of PDI in mesenteric resistance arteries compared with Wistar controls; however, its consequences remain unclear. Herein, we investigated the role of PDI in mediating Nox1 transcriptional upregulation and its effects on vascular dysfunction in hypertension. We demonstrate that PDI contributes to the development of hypertension via enhanced transcriptional upregulation of Nox1 in vascular smooth muscle cells (VSMCs). We show for the first time that PDI sulfenylation by hydrogen peroxide contributes to EGFR activation in hypertension via increased shedding of epidermal growth factor-like ligands. PDI also increases intracellular calcium levels, and contractile responses induced by ANG II. PDI silencing or pharmacological inhibition in VSMCs significantly decreases EGFR activation and Nox1 transcription. Overexpression of PDI in VSMCs enhances ANG II-induced EGFR activation and ATF1 translocation to the nucleus. Mechanistically, PDI increases ATF1-induced Nox1 transcription and enhances the contractile responses to ANG II. Herein we show that ATF1 binding to Nox1 transcription putative regulatory regions is augmented by PDI. Altogether, we provide evidence that HB-EGF in SHR resistance vessels promotes the nuclear translocation of ATF1, under the control of PDI, and thereby induces Nox1 gene expression and increases vascular reactivity. Thus, PDI acts as a thiol redox-dependent enhancer of vascular dysfunction in hypertension and could represent a novel therapeutic target for the treatment of this disease