Bases moleculares de la interacción simbiótica eficiente entre <i>Phaseolus vulgaris</i> y <i>Rhizobium etli</i>

Las leguminosas establecen una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Cuando la planta crece en condiciones limitantes de nitrógeno comienza un intercambio de señales químicas con especies de rizobios compatibles presentes en la rizósfera, que permite un reconocimiento mutuo muy específico. La bacteria se adhiere a la punta de los pelos radicales, y la planta genera una estructura tubular llamada hilo de infección que permite el avance de la bacteria hacia las células del córtex. Allí se activan las divisiones celulares formando un nuevo órgano llamado nódulo, donde los rizobios son internalizados al citoplasma de las células vegetales y se lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico a formas fácilmente asimilables por la planta. Phaseolus vulgaris (poroto) es una leguminosa de origen americano que ha diversificado genéticamente en dos centros geográficos independientes, el Andino y el Mesoamericano. El estudio molecular de la diversidad de rizobios presentes en nódulos ha permitido determinar que Rhizobium etli es la especie que ocupa predominantemente los nódulos de P. vulgaris. A su vez, los cultivares de origen Mesoamericano nodulan preferentemente y de manera más eficiente con cepas que poseen el alelo tipo α en el gen nodC, mientras que las plantas de origen Andino nodulan más eficientemente con cepas con un alelo tipo δ. Este sistema representa un excelente modelo experimental para el estudio de los determinantes moleculares que participan en el reconocimiento específico entre ambos simbiontes y lleva al establecimiento de una interacción preferencial y más eficiente. Estudios previos de nuestro laboratorio permitieron identificar y caracterizar a nivel funcional distintos genes implicados en esta respuesta. Uno de ellos codifica para la subunidad C1 del factor de transcripción NF-Y, el cual es un regulador transcripcional requerido tanto para la infección bacteriana y la organogénesis del nódulo, como para la nodulación preferencial por cepas nodC-α. La subunidad NF-YC1 interacciona con las subunidades NF-YA1 y NF-YB7 formando un trímero funcional en la simbiosis. A su vez, NF-YC1 interacciona físicamente con un factor de transcripción de la familia GRAS denominado SIN1, el cual es requerido para la infección y organogénesis del nódulo, así como también para el desarrollo de raíces laterales, siendo un excelente ejemplo de la interconexión de programas transcripcionales en el desarrollo de dos órganos diferentes. En la presente Tesis doctoral se abordó la caracterización de las bases moleculares de una interacción simbiótica eficiente mediante el análisis transcriptómico por secuenciación masiva de ARN de raíces de plantas de poroto de origen Mesoamericano y Andino inoculadas con cepas tipo nodC-α, nodC-δ o con medio de cultivo a modo de control. Este análisis permitió identificar genes que se expresen de manera diferencial frente a las cepas más eficientes, y además, distinguir las respuestas moleculares específicas de cada cultivar frente a cada cepa. Estos genes codifican proteínas involucradas en diferentes procesos de percepción y señalización, regulación de la transcripción, procesos rédox y en modificaciones de la pared celular y la membrana plasmática, los cuales son requeridos para la iniciación y progresión de los hilos de infección. En una segunda etapa de este trabajo de Tesis se identificaron genes que son regulados de manera directa por los factores de transcripción NF-YC1, NF-YA1 y SIN en etapas tempranas de la simbiosis entre P. vulgaris y R. etli. Para ello se utilizaron plantas que expresan de manera ectópica y constitutiva estos factores de transcripción como fusiones traduccionales al epitope FLAG, las cuales se utilizaron en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) para identificar genes regulados directamente por dichos factores transcripcionales. Esta aproximación experimental permitió identificar genes que participan en la activación de las divisiones mitóticas y de la infección rizobiana. Por último, para profundizar en el conocimiento sobre la vía de transducción de señales que involucra a NF-YC1, en nuestro laboratorio se realizó un screening de una biblioteca de doble híbrido de levadura para identificar proteínas que interaccionen físicamente con NF-YC1. Uno de los clones identificados codifica una proteína quinasa, a la cual denominamos NF-YC1 Interacting Protein Kinase (NIPK). La interacción física entre NF-YC1 y NIPK fue confirmada mediante ensayos de doble híbrido, complementación bimolecular de fluorescencia y ensayos de co-inmunopreciptación. Posteriormente se caracterizó la localización subcelular de NIPK detectándose tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática. La caracterización fenotípica de plantas de P. vulgaris silenciadas en NIPK utilizando dos RNA de interferencia (RNAi) dirigidos a diferentes regiones del mRNA, revelaron que NIPK sería requerido para la organogénesis y desarrollo de los nódulos, así como también la frecuencia de la infección rizobiana. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de Tesis no sólo contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, sino que también sienta las bases para futuros proyectos de investigación y desarrollo que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de interés agronómico y alto valor social para los pueblos del Noroeste Argentino.Facultad de Ciencias Exacta

Nitrogen and the Punishment of Tántalo

El alimento de aproximadamente la mitad de la población mundial, unas 3.700 millones de personas, depende directamente de la producción de fertilizantes sintéticos. Estos productos químicos aportan al suelo la cantidad de nitrógeno necesaria para que los cultivos alcancen los niveles de producción requeridos para alimentar al mundo. La humanidad ha alcanzado un grado de dependencia tal que, sin los fertilizantes, la mitad del planeta no tendría que comer. El consumo de estos compuestos sobrepasa ya las 100 millones de toneladas anuales y las consecuencias de este exceso están generando diversos y serios problemas ambientales, haciendo de la agricultura moderna una práctica no sustentable. En este contexto, las plantas leguminosas (poroto, maní, arveja, soja, alfalfa, etc.) toman un rol protagónico en la agricultura, ya que son capaces de obtener nitrógeno mediante un mecanismo biológico conocido como simbiosis fijadora de nitrógeno, haciendo innecesario el uso de fertilizantes para su crecimiento. Por este motivo, las Naciones Unidas ha proclamado el 2016 como el año internacional de las legumbres (http://www.fao.org/pulses-2016/es/). El presente artículo pretende dar a conocer y divulgar la importancia de esta iniciativa a través de una visión histórica de la problemática del nitrógeno en la agricultura, tomando como eje central la fijación biológica de nitrógeno.The food of half of the world's population, about 3.7 billion people, depends directly on the production of synthetic fertilizers. These chemicals provide the soil with the amount of nitrogen needed for crops to reach the levels of production required to feed the world. We have reached a degree of dependence that, without fertilizers, half the planet would not have to eat. The consumption of these compounds already exceeds 100 million tons per year and the consequences of this excess are generating diverse and serious environmental problems, making of modern agriculture an unsustainable practice. In this context, leguminous plants (peanut, peanuts, peas, soybeans, alfalfa, etc.) take a leading role in agriculture, as they are able to obtain nitrogen through an elegant biological mechanism known as nitrogen fixing symbiosis, making unnecessary the use of fertilizers for their growth. For this reason, the United Nations has proclaimed 2016 as the International Year of Legumes (http://www.fao.org/pulses-2016/en/). The present article aims to publicize the importance of this initiative through a historical view of the nitrogen problem in agriculture, taking as a central axis the biological nitrogen fixation.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

An immunocytochemical approach to the analysis of the cell division cycle in the rat cerebellar neuroepithelium

Cerebellar neurons are generated from the rhombic lip and the neuroepithelium. In this study, we analyze the histogenesis of the cerebellar neuroepithelium in terms of cellular kinetics. The experimental animals are the offspring of pregnant dams injected with 5-bromo-2ʹ-deoxyuridine (BrdU) on embryonic day 13. We infer the fraction of S-phase cells by examining a range of survival times after a single BrdU-exposure and a cumulative BrdU-labeling sequence, which allow for the derivation of cell-cycle parameters and phase durations. The current results indicate that the dose of BrdU employed (35 mg/kg) provides saturation S-phase labeling from at least 1 h after marker delivery. The duration of G2, mitotic phase, and G1 are 1.2, 0.5, and 6.9 h, respectively. The duration for the S-phase, growth fraction, and the whole cycle are obtained on the basis of two proliferative models, steady-state and exponential growth. Both models provided similar results. In conclusion, our results indicate that the steady-state and the cumulative S-phase labeling paradigms can be adopted to analyze cell cycle parameters in the cerebellar neuroepithelium. Current results can help in understanding the regulatory mechanisms of cerebellar histogenesis and the cell biological mechanisms of the proliferative cycle of the neuroepithelium

Nitrogen and the Punishment of Tántalo

El alimento de aproximadamente la mitad de la población mundial, unas 3.700 millones de personas, depende directamente de la producción de fertilizantes sintéticos. Estos productos químicos aportan al suelo la cantidad de nitrógeno necesaria para que los cultivos alcancen los niveles de producción requeridos para alimentar al mundo. La humanidad ha alcanzado un grado de dependencia tal que, sin los fertilizantes, la mitad del planeta no tendría que comer. El consumo de estos compuestos sobrepasa ya las 100 millones de toneladas anuales y las consecuencias de este exceso están generando diversos y serios problemas ambientales, haciendo de la agricultura moderna una práctica no sustentable. En este contexto, las plantas leguminosas (poroto, maní, arveja, soja, alfalfa, etc.) toman un rol protagónico en la agricultura, ya que son capaces de obtener nitrógeno mediante un mecanismo biológico conocido como simbiosis fijadora de nitrógeno, haciendo innecesario el uso de fertilizantes para su crecimiento. Por este motivo, las Naciones Unidas ha proclamado el 2016 como el año internacional de las legumbres (http://www.fao.org/pulses-2016/es/). El presente artículo pretende dar a conocer y divulgar la importancia de esta iniciativa a través de una visión histórica de la problemática del nitrógeno en la agricultura, tomando como eje central la fijación biológica de nitrógeno.The food of half of the world's population, about 3.7 billion people, depends directly on the production of synthetic fertilizers. These chemicals provide the soil with the amount of nitrogen needed for crops to reach the levels of production required to feed the world. We have reached a degree of dependence that, without fertilizers, half the planet would not have to eat. The consumption of these compounds already exceeds 100 million tons per year and the consequences of this excess are generating diverse and serious environmental problems, making of modern agriculture an unsustainable practice. In this context, leguminous plants (peanut, peanuts, peas, soybeans, alfalfa, etc.) take a leading role in agriculture, as they are able to obtain nitrogen through an elegant biological mechanism known as nitrogen fixing symbiosis, making unnecessary the use of fertilizers for their growth. For this reason, the United Nations has proclaimed 2016 as the International Year of Legumes (http://www.fao.org/pulses-2016/en/). The present article aims to publicize the importance of this initiative through a historical view of the nitrogen problem in agriculture, taking as a central axis the biological nitrogen fixation.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

És segur el fàrmac Hidroxiurea per al tractament de les hemopaties en dones gestants i nens?

La hidroxiurea és un medicament utilitzat en el tractament d'un ampli espectre d'afeccions tals com a tumors, infeccions víriques i hemopaties. Les dades bibliogràfiques semblen indicar que manca d'efectes fetotòxics quan s'administra a dones gestants. Els mateixos referents també suggereixen que és segur en nens de poca edat. Alguns autors han mostrat que aquesta droga pot estar relacionada amb alteracions durant el desenvolupament encefàlic humà. Els resultats d'aquest estudi, obtinguts en rosegadors, posen en dubte la seguretat de la hidroxiurea en etapes crítiques de la formació del sistema nerviós central i proposen que es necessiten més experiments per determinar els efectes adversos d'aquest antimetabòlit.La hidroxiurea es un medicamento utilizado en el tratamiento de un amplio espectro de afecciones tales como tumores, infecciones víricas y hemopatías. Los datos bibliográficos parecen indicar que carece de efectos fetotóxicos cuando se administra a mujeres gestantes. Los mismos referentes también sugieren que es seguro en niños de corta edad. Algunos autores han mostrado que esta droga puede estar relacionada con alteraciones durante el desarrollo encefálico humano. Nuestros resultados, obtenidos en roedores, ponen en duda la seguridad de hidroxiurea en etapas críticas de la formación del sistema nervioso central y proponen que se necesitan más experimentos para determinar los efectos adversos de este antimetabolito

Natural apoptosis in developing mice dopamine midbrain neurons and vermal Purkinje cells

Natural cell death by apoptosis was studied in two neuronal populations of BALB/c, C57BL/6 and B6CBA-Aw-j/A hybrid stock mice: (I) dopaminergic (DA) neurons in choosing coronal levels throughout the anteroposterior extent of the substantia nigra pars compacta (SNc), and (II) Purkinje cells (PCs) in each vermal lobe of the cerebellar cortex. Mice were collected at postnatal day (P) 2 and P14 for the midbrain study, and at P4 and P7 for the analysis of the cerebellum. No DA cells with morphologic criteria for apoptosis were found. Moreover, when the combination of tyrosine hydroxylase and TUNEL or tyrosine hydroxylase and active caspase-3 immunohistochemistry were performed in the same tissue section, no DA cells TUNEL positives or active caspase-3-stained DA neurons were seen. On the other hand, when PCs were considered, data analysis revealed that more dying PCs were observed at P4 than at P7. Values of neuron death were highest in the central lobe; this was followed by the posterior and anterior lobes and then by the inferior lobe. To determine if apoptotic death of PCs is linked to their time-of-origin profiles, pregnant dams were administered with [3H]TdR on embryonic days 11-12, 12-13, 13-14 and 14-15. When TUNEL and [3H]TdR autoradiography or active caspase-3 immunohistochemistry and [3H]TdR autoradiography were combined in the same tissue section, results reveal that the naturally occurring PC death is not related to its time of origin but, rather, is random across age

Natural apoptosis in developing mice dopamine midbrain neurons and vermal Purkinje cells

Natural cell death by apoptosis was studied in two neuronal populations of BALB/c, C57BL/6 and B6CBA-A/A hybrid stock mice: (I) dopaminergic (DA) neurons in choosing coronal levels throughout the anteroposterior extent of the substantia nigra pars compacta (SNc), and (II) Purkinje cells (PCs) in each vermal lobe of the cerebellar cortex. Mice were collected at postnatal day (P) 2 and P14 for the midbrain study, and at P4 and P7 for the analysis of the cerebellum. No DA cells with morphologic criteria for apoptosis were found. Moreover, when the combination of tyrosine hydroxylase and TUNEL or tyrosine hydroxylase and active caspase-3 immunohistochemistry were performed in the same tissue section, no DA cells TUNEL positives or active caspase-3-stained DA neurons were seen. On the other hand, when PCs were considered, data analysis revealed that more dying PCs were observed at P4 than at P7. Values of neuron death were highest in the central lobe; this was followed by the posterior and anterior lobes and then by the inferior lobe. To determine if apoptotic death of PCs is linked to their time-of-origin profiles, pregnant dams were administered with [H]TdR on embryonic days 11-12, 12-13, 13-14 and 14-15. When TUNEL and [H]TdR autoradiography or active caspase-3 immunohistochemistry and [H]TdR autoradiography were combined in the same tissue section, results reveal that the naturally occurring PC death is not related to its time of origin but, rather, is random across age

L'administració d'hidroxiurea provoca apoptosi i autofàgia als neuroblasts de la capa granular externa del còrtex cerebel·lós

La capa granular externa del còrtex cerebel·lós és una estructura temporal responsable de la generació de les neurones granulars. Aquesta matriu germinal presenta neuroblasts amb una marcada capacitat proliferativa. L'estudi següent analitza, a les rates, l'impacte del fàrmac hidroxiurea sobre els precursors neuronals de l'esmentada capa. Els nostres resultats permeten conèixer els canvis que es produeix a l'arquitectura cerebel·losa, i les respostes cel·lulars que es produeixen com a conseqüència de l'administració d'agents citostàtics.La capa granular externa del córtex cerebeloso es una estructura temporal responsable de la generación de las neuronas granulares. Esta matriz germinal presenta neuroblastos con una elevada capacidad proliferativa. El siguiente estudio analiza, en ratas, el impacto del fármaco hidroxiurea sobre los precursores neuronales de la mencionada capa. Nuestros resultados permiten conocer los cambios que se producen en la arquitectura cerebelosa, i las respuestas celulares producidas como consecuencia de la administración de agentes citoestáticos.The cerebellar external granular layer is a temporary structure involved in the generation of granular neurons. This germinal matrix presents neuroblast with a high proliferative activity. This current study analyzes, in rats, the effect of hydroxyurea exposition on the neuronal progenitors of the aforementioned structure. Our results allow to know the changes that occur in the cerebellar architecture, as well as the cellular responses produced as a consequence of the administration of cytostatic agents

Annotation, phylogeny and expression analysis of the Nuclear factor Y gene families in common bean (<i>Phaseolus Vulgaris</i>)

In the past decade, plant nuclear factor Y (NF-Y) genes have gained major interest due to their roles in many biological processes in plant development or adaptation to environmental conditions, particularly in the root nodule symbiosis established between legume plants and nitrogen fixing bacteria. NF-Ys are heterotrimeric transcriptional complexes composed of three subunits, NF-YA, NF-YB, and NF-YC, which bind with high affinity and specificity to the CCAAT box, a cis element present in many eukaryotic promoters. In plants, NF-Y subunits consist of gene families with about 10 members each. In this study, we have identified and characterized the NF-Y gene families of common bean (Phaseolus vulgaris), a grain legume of worldwide economical importance and the main source of dietary protein of developing countries. Expression analysis showed that some members of each family are up-regulated at early or late stages of the nitrogen fixing symbiotic interaction with its partner Rhizobium etli. We also showed that some genes are differentially accumulated in response to inoculation with high or less efficient R. etli strains, constituting excellent candidates to participate in the strain-specific response during symbiosis. Genes of the NF-YA family exhibit a highly structured intron-exon organization. Moreover, this family is characterized by the presence of upstream ORFs when introns in the 5' UTR are retained and miRNA target sites in their 3' UTR, suggesting that these genes might be subjected to a complex post-transcriptional regulation. Multiple protein alignments indicated the presence of highly conserved domains in each of the NF-Y families, presumably involved in subunit interactions and DNA binding. The analysis presented here constitutes a starting point to understand the regulation and biological function of individual members of the NF-Y families in different developmental processes in this grain legume.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula