Contribuição dos primers obtidos de subunidades do RNA ribossômico para discriminação entre Babesia bigemina e Babesia bovis por PCR

ABSTRACTSix pairs of species-specific primers were designed from the alignment of the sequences of the SS rRNA gene obtained from the Genbank database for Babesia bigemina (accession number X59604) and for B. bovis (accession number U06105). Three pairs of primers were designed specifically for B. bigemina and another 3 sets of primers for B. bovis. All oligonucleotide sequences selected as primers were examined for similarities to other organisms through the Genbank Blast procedure and these 6 sets of primers demonstrated high level of specificity. The synthetic oligonucleotides were also tested for specificity by PCR assay using genomic DNA extracted from 40 isolates of B. bigemina and 30 from B. bovis, obtained in six different States ofBrazil.All 6 sets of primerswere validated as 100% specific for the respective parasite. The PCR amplified the expected fragments for each set of primers, as follows: a) B. bigemina: primersGAU5forward/GAU6 reversewith amplicon of 1,124 bp; primers GAU5 forward/GAU8 reverse with amplicon of 458 bp; primersGAU7 forward/GAU6 reversewith amplicon of 685 bp; b) B. bovis: primersGAU9 forward/GAU10 reverse with amplicon of 541 bp; primers GAU9 forward/GAU 13 reverse with amplicon of 883 bp; primers SOGIN forward/ GAU10 with amplicon of 1211 bp. ______________________________________________________________________________ RESUMOSeis pares de primers espécie-específicos foram construídos a partir do alinhamento do gene SS rRNA de Babesia bigemina (número de acesso no Genbank: X59604) e Babesia bovis (número de acesso U06105). Três pares de primers foramconstruídos especificamente para B. bigemina e outros três para B. bovis. As seqüências de oligonucleotídeos, selecionadas como primers, apresentaramelevada especificidade na avaliação quanto à similaridades a outros microrganismos, através do procedimento designado “basic local alignment search tool (BLAST)” do Genbank. Os oligonucleotídeos sintéticos foram também avaliados quanto à especificidade através da reação de PCR, utilizando-se DNA genômico extraído de 40 isolados de B. bigemina e 30 de B. bovis procedentes de seis estados do Brasil. Os resultados da amplificação foram100% específicos para todos os pares de primers testados, obtendo-se, como produtos de PCR, fragmentos de tamanhos esperados para cada combinação de primers e DNA utilizados, como segue: a) B. bigemina: primers GAU5/GAU6 = amplicon de 1124 pares de base (pb); primers GAU5/GAU8 = amplicon de 458 pb; primersGAU7/GAU6 = amplicon de 685 pb; b) B. bovis: primersGAU9/GAU10 = amplicon de 541 pb; primers GAU9/GAU13 =amplicon de 883; primersSOGIN/GAU10 = amplicon de 1211 pb

Babesiose cerebral por Babesia bovis (Babés 1888 Starcovici 1893) em bezerros, no Estado de Mato Grosso do Sul

Three cases of death caused by Babesia bovis, One in a 13-day-old Nelore x Fleckvieh female calf, one in a 25-day-old Ibagé male calf and one in a 108-day-old Nelore male calf are described. All were acute cases without the possibility of an in vivo diagnosis or treatment. The diagnosis was based on necropsy, microscopic examination of twain, kidney and heart preparations stained by May-Grünwald-Giemsa and histopathology examination of the various, internal organs stained by Haematoxylin-Eosin. The specific in diagnosis was based on the morphology of the organisms and the characteristical localization of parasitized erythrocytes in the blood capillaries of the internal organs. This is the first notification of the occurrence of clinical cases of babesiosis by S. bovis in Mato Grosso do Sul, Brazil.São descritos três casos de morte de bezerros causadas por B. bovis, sendo uma bezerra cruzamento Nelore x Fleckvieh, de treze dias de idade, um bezerro Ibagé, de 25 dias, e um bezerro Nelore de 108 dias. Todos os casos foram agudos, não havendo possibilidade de diagnóstico in vivo ou tratamento. O diagnóstico foi baseado nos achados de necropsia, exame microscópico de esfregaços de cérebro, rins e coração, corados por May-Grünwald-Giemsa e exame histopatológico de diversos órgãos, corados por hematoxilina-eosina. As características morfológicas e a localização característica dos eritrócitos parasitados nos capilares dos órgãos internos basearam o diagnóstico específico. Esta é a primeira notificação da ocorrência de casos clínicos de babesiose por B. bovis no Mato Grosso do Sul, Brasil

Development of live attenuated strains of Babesia bovis and Babesia bigemina: preliminary test

Foram efetivadas 16 passagens de B. bovis em bezerros esplenectomizados e quatro passagens de B. bigemina em bezerros intactos com o objetivo de desenvolver cepas atenuadas para posterior uso como vacina, de acordo com a tecnologia australiana. O teste preliminar da virulência e antigenicidade destas cepas, realizado a campo, em novilhos Hereford de dois anos de idade revelou que: 1) a cepa de B. bovis apresenta baixa virulência, uma vez que os animais inoculados não apresentaram sinais clínicos da doença durante a reação vacinal; 2) a cepa de B. bigemina apresenta ainda um grau elevado de virulência pois, dos cinco novilhos inoculados, três apresentaram sintomatologia clínica embora tenham se recuperado espontaneamente da infecção; 3) ambas as cepas apresentaram alta antigenicidade pois todos os animais inoculados apresentaram sorologicamente positivos ao teste de imunofluorescência indireta específico e resistiram ao desafio homólogo com as respectivas cepas virulentas, enquanto nos grupos testemunha, todos os novilhos sofreram a doença aguda e, apesar de devidamente medicados, um morreu.With the objective of developing local strains of Babesia bovis and Babesia bigemina attenuated according to the Australian method, sixteen rapid passages of B. bovis in splenectomized calves and four slow passages of B. bigemina in intact calves were made. A preliminary test of the virulence and antigenicity of these strains in two-year old Hereford steers in the field showed that: 1) the B. bovis strain was of low virulence as the inoculated animals did not present clinical signs of the disease during the vaccine reaction; 2) the B. bigemina strain was still too virulent since three of five inoculated steers presented visible clinical signs, although all recovered spontaneously from the infection; 3) both strains were highly antigenic as all inoculated animals were positive for the indirect fluorescent antibody test and resisted the homologous challenge with the respective virulent strain, while all of the non-vaccinated controls became acutely ill and although properly medicated, one died

Dinamic of natural infection in newborn calves exposed to by Babesia bigemina as detected by Polimerase reaction chain

Com o objetivo de estudar por PCR a dinâmica da infecção natural da Babesia bigemina em bezerros criados em sistema extensivo, foram colhidas 266 amostras de sangue de um grupo de 37 bezerros, a partir do nascimento até aproximadamente 165 dias de vida, com intervalo médio de 19 dias entre as colheitas. Distribuíram-se as amostras de acordo com os grupos de diferentes faixas etárias (entre 0 e 15 dias, entre 16 e 30 dias e assim sucessivamente até 165 dias). Do total de 266 amostras, 116 (43,60%) mostraram- se positivas para a PCR. A reação foi capaz de detectar a presença do parasito em todos os intervalos das colheitas e registrou-se o maior número de primo-infecções – 12 em 37 (32,43%) – no período de 31 a 45 dias. Dos 37 bezerros estudados, apenas um apresentou resultado da PCR positivo nos dois grupos de faixa etária inferior a 31 dias. Este animal apresentava dois dias de vida no momento da colheita, sugerindo um caso de transmissão transplacentária de B. bigemina. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTWith the objetive of using PCR to study the dynamic of natural infection caused by Babesia bigemina in calves livestock in extensive system, 266 samples of blood were collected from a group of 37 calves from birth to approximately 165 days old. The samples were collected with an average intervale of 19 days and distributed according to age 0 to 15 days old, 16 to 30 days and successively until 165 days. Out of the total of the 266 samples, 116 (43.60%) were PCR positive. The reaction detected the presence of the parasite in all the intervals of collection and most of the prime infection, 12 in 37 (32.43%) were detected in the period between 31 and 45 days. Out of the 37 calves analysed, only one presented a positive PCR result within the two groups aged under 31 days. This animal was two days old at the moment of the collection. This result suggest a case of transplacentary transmission of Babesia bigemina

AVALIAÇÕES DA PARASITEMIA, DO HEMATÓCRITO E DOS NÍVEIS BIOQUÍMICOS SÉRICOS, DE BEZERROS NELORE (Bos indicus), INOCULADOS COM ISOLADOS DE Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893) DAS REGIÕES SUL, SUDESTE, CENTRO-OESTE, NORDESTE E NORTE DO BRASIL

Avaliaram-se a parasitemia, o hematócrito e os níveis séricos de bilirrubina total, creatinina, uréia e colesterol de bezerros Nelore (Bos indicus) inoculados com isolados de Babesia bigemina das cinco regiões fisiográficas do Brasil. Constatou-se que os diferentes isolados desenvolveram baixa parasitemia, nos animais experimentalmente inoculados, diminuição do colesterol sérico, e que não houve variações nos níveis de bilirrubina, creatinina e uréia sérica. PALAVRAS-CHAVE: Bos indicus, Babesia bigemina, parasitemia, bioquímica sérica

Diagnosis of Babesia bigemina by polymerase chain reaction (PCR) using GAU6 and GAU7 primers for SSrRNA fragment

O presente trabalho teve como finalidade avaliar o protocolo da reação cm cadeia da polimerase (PCR) com prímers GAU6 e GAU7 para amplificação específica de um fragmento do gene que codifica para SS rRNA de B. bigemina com amostras de sangue de bovino contendo os isolados de Babesia bigemina, Babesia bovis e Anaplasma marginale. Foram realizadas 40 reações para as amostras de sangue que continham hemoparasitos, sendo 14 reações de PCR para Babesia bigemina, 12 para reações para Babesia bovis e 14 para Anaplasma marginale. Para a extração do DNA das amostras de sangue, seguiu-se o protocolo de extração do kit comercial GFX™ Pharmacia Biotechâ; as amostras foram submetidas à reação do PCR previamente descrita por LINHARES et al. (2000). Os resultados obtidos demonstraram ser os primers GAU6 e GAU7 específicos para Babesia bigemina, não apresentando reação positiva para os parasitos Babesia bovis e Anaplasma marginale, bem como o DNA extraído de sangue de bovino livre de infecção. ______________________________________________________________________________ SUMMARYThe present study was carried out to evaluate the polymerase chain reaction (PCR) protocol with GAU6 and GAU7 primers for the SSrRNA of Babesia bigemina in cattle blood containg Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale. Forty reactions were carried out for blood samples with haemo-parasites, 14 PCR for Babesia bigemina, 12 for Babesia bovis and 14 for Anaplasma marginale. DNA was extracted from the blood samples using the commercial GFX™ Pharmacia Biotechâ, and then the PCR protocol as described by LINHARES et al. (2000). The results show that the GAU6 and GAU7 primers are specific for Babesia bigemina and did not show a positive reaction for the Babesia bovis and Anaplasma marginale parasites. No reaction was obtained with DNA extracted from blood of healthy cattle

Reação da polimerase em cadeia tempo real para diagnóstico de Anaplasma marginale em bovino e veado campeiro do Pantanal brasileiro Ozotoceros bezoarticus leucogaster

Epizootiological study of Anaplasma marginale in regions that contain various reservoir hosts, co-existence of rickettsia pathogens, and common vectors is a complicated task. To achieve diagnosis of this rickettsia in cattle and campeiro deer of Brazilian Pantanal, a comparison was made between a real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with intercalating Sybr Green fluorochrome and primers based on msp5 gene of A. marginale; a conventional PCR (C-PCR); and parasitological examination using thin blood smear stained with Giemsa-MayGrunwald. Both PCRs showed good performance in the diagnosis of A. marginale in cattle, and were superior to the parasitological exam. The RT-PCR detected seven positive campeiro deer (16.3%). This rate was significantly higher compared to C-PCR, which identified one animal as positive (2.3%), and also compared to parasitological diagnosis, which did not find any positive animals. The dissociation temperature average of positive reactions in cattle (81.72 ºC ± 0.20) was identical to dissociation temperature found in the cervids (81.72 ºC ± 0.12), suggesting that both animal species were infected with A. marginale. We concluded that RT-PCR can be used for A. marginale diagnosis and in epizootiological studies of cattle and cervids; in spite of the small number of campeiro deer samples, the results indicated that this wildlife species has importance in the Anaplasma epizootiology in the Brazilian Pantanal.O estudo epizootiológico de Anaplasma marginale em regiões que existem vários reservatórios, co-existência de espécies de riquétsias patógenas e vetores comuns é uma tarefa complicada. Com o objetivo de obter o diagnóstico dessa riquétsia em bovinos e veado campeiro do Pantanal brasileiro foi avaliada uma reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR-TR) com o fluoróforo intercalante de fita dupla de DNA Sybr Green e iniciadores baseados na seqüência do gene msp5 de A. marginale comparando-a a uma PCR convencional (PCR-C) e ao exame parasitológico de esfregaço fino de sangue corado com Giemsa-MayGrunwald. Ambas PCRs apresentaram bom desempenho no diagnóstico de A. marginale nos bovinos, o qual foi superior ao exame parasitológico. O PCR-TR detectou sete veados campeiros positivos (16,3%), o que foi significativamente maior comparado ao PCR-C identificando um animal como positivo (2,3%), e ao exame parasitológico não encontrou nenhum animal positivo. A média da temperatura de dissociação das reações positivas para amostras de bovinos (81,72 ºC ± 0,20) foi idêntica àquelas dos cervídeos ( 81,72 ºC ± 0,12), o que sugere que ambas espécies animais foram infectadas por A. marginale. Concluímos que PCR-TR pode ser utilizada para diagnóstico e estudos epizootiológicos de A. marginale em bovinos e cervídeos. Apesar da pequena amostragem de veado campeiro os resultados indicam que essa espécie de animal selvagem tem importância na epizootiologia do Anaplasma no Pantanal brasileiro