Arcobacter spp. in environmental waters in Sicily: occurrence, antimicrobial resistance and relationship with bacteria indicators of fecal pollution

Arcobacter spp. are emerging enteropathogens and potential zoonotic agents that can be transmitted by food and water. The species A. butzleri and A. cryaerophilus have been associated with bacteremia, gastroenteritis and diarrhea in humans and with abortion and diarrhea in animals: the water plays an important role in the transmission. Aims of the present study were to evaluate the presence of Arcobacter spp. from different water sources, to assessed the possible correlation with the levels of fecal indicator bacteria and to determine the antimicrobial resistance of the isolates

Microbial diversity of traditional Sicilian cheeses

Traditional Sicilian cheeses are manufactured in small size farms with raw milk from animals of indigenous breeds and without the addition of starter cultures. In order to transform milk into cheese, the presence of lactic acid bacteria (LAB) is required. The main sources of desirable LAB are generally the milk, the rennet, the equipment used during processing and the dairy environment. In the last years, the microbial characterisation of traditional Sicilian cheeses, such as Caciocavallo Palermitano, Protected Designation of Origin (PDO) Pecorino Siciliano and PDO Vastedda della valle del Belìce have been the object of different studies conducted by our research group. To this purpose, the aim of the present study was to describe the microbial population of traditional Sicilian cheeses. The analysis of the microbial diversity of these cheeses revealed the presence of several dairy LAB at dominant levels, while the undesired microorganisms, including coliforms and coagulase-positive staphylococci (CPS), were at very low densities. Overall, the presence of the pathogenic bacteria Listeria monocytogenes and Salmonella spp. was never detected. This may be due to the quality of milk, the optimal maintenance of wooden vats and on following good production practices. Furthermore, the technological characterisation of the LAB found in these cheeses and in raw materials showed interesting dairy properties, including acidification capacity, diacetyl formation, autolytic properties and the ability to inhibit undesired bacteria

Formation and Characterization of Early Bacterial Biofilms on Different Wood Typologies Applied in Dairy Production

The main hypothesis of this work was that Sicilian forestry resources are suitable for the production of equipment to be used in cheese making and indigenous milk lactic acid bacteria (LAB) are able to develop stable biofilms providing starter and nonstarter cultures necessary for curd fermentation and cheese ripening, respectively. Hence, the present work was carried out with deproteinized whey to evaluate LAB biofilm formation on different woods derived from tree species grown in Sicily. Microbiological and scanning electron microscopy analyses showed minimal differences in microbial levels and compositions for the neoformed biofilms. The specific investigation of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, coagulase-positive staphylococci (CPS), and sulfite-reducing anaerobes did not generate any colony for all vats before and after bacterial adhesion. LAB populations dominated all vat surfaces. The highest levels (7.63 log CFU/cm2) were registered for thermophilic cocci. Different colonies were characterized physiologically, biochemically, and genetically (at strain and species levels). Six species within the genera Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, and Streptococcus were identified. The species most frequently present were Lactobacillus fermentum and Lactococcus lactis. LAB found on the surfaces of the wooden vats in this study showed interesting characteristics important for dairy manufacture. To thoroughly investigate the safety of the wooden vat, a test of artificial contamination on new Calabrian chestnut (control wood) vats was carried out. The results showed that LAB represent efficient barriers to the adhesion of the main dairy pathogens, probably due to their acidity and bacteriocin generation. IMPORTANCE This study highlights the importance of using wooden vats for traditional cheese production and provides evidence for the valorization the Sicilian forest wood resources via the production of dairy equipment

Evolution of the lactic acid bacterial biofilms on different wood typologies applied for the production of vats intended for cheese making

The present work was carried out to evaluate the lactic acid bacterial biofilms formation on wooden vat produced with seven different woods, derived from trees species grown in Sicily. The biofilm formation on the wooden surfaces was performed as reported by Gaglio et al. Microbiological and scanning electron microscopy analyses did not show differences in terms of microbial levels and composition within the neoformed biofilms (Fig.1). The specific investigation of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli and positive-coagulase staphylococci did not generate any colony for all vats before and after microbial activation. Lactic acid bacteria (LAB) populations dominated the surfaces of all vats and the highest concentration of approximately 7.63 Log CFU/cm2 was registered for thermophilic cocci. All colonies of different morphologies were isolated and characterized for their physiological and biochemical characteristics before being investigated genetically at strain level by RAPD-PCR and species level by a polyphasic approach consisting of 16S rRNA gene sequencing. As reported in a preview investigation conducted on wooden vat surfaces. we found species within the genera Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, and Streptococcus. The species most frequently present were Lactobacillus fermentum and Lactococcus lactis. The technological characterization of the LAB found at high numbers on to the surfaces of the wooden vats showed interesting dairy properties. In order to deeply investigate on the safety of the wooden vat, a test of artificial contamination on new Calabrian chestnut vats was carried out showing that the acidity and the bacteriocin generated by LAB represent efficient barriers to their adhesion. This study highlights the importance to use the wooden vats for traditional cheese production and provides evidences for their safety in terms of bacterial community evolution

Indagine sulla presenza di Salmonella spp. nelle spezie

In the last decades, food-borne infections and food poisoning, due to spices, have increased, in several European countries. The main cause is the improved consumption of ready-to-eat food and increased use of spices in food. A total of 158 samples of spices were analyzed from 2015 to 2019, they were collected in Palermo district, at commercialization or import phase. All samples were analysed for Salmonella spp. All microorganisms isolated were subjected to antibiotic resistance assay. The results of the analysis showed a satisfying hygienic quality of spices, only four samples (2,5%) of sesame showed the presence of Salmonella spp.. The Salmonella isolated strains showed sensitivity to all antibiotics tested except the ampicillin and gentamicin. The strain of S. Maastricht, instead, showed sensitivity to ampicillin and resistance to gentamicin, kanamycin, streptomycin and tetraciclin

Prevalenza e profili di antimicrobicoresistenza in Salmonella spp isolata da alimenti nel triennio 2019-2021

Summary Salmonella spp. is among the most frequent causes of foodborne diseases, and the increasing occurrence of MDR strains is an additional cause for concern. In the three-year period 2019-2021, we collected Salmonella spp. strains isolated from different food categories analyzed in the context of Regulation (EC) No 2073/2005, to assess their antibiotic susceptibility profile and ESBLs production. To determine the susceptibility profile and identify MDR strains, we performed the Kirby-Bauer method by testing 17 antibiotics belonging to different classes, moreover the double disc test therefore allowed us to evaluate ESBL production. Phenotypic tests showed that 36/67 strains are MDR and 53% of these are ESBLs producers. Our results confirmed the prevalence of S. Infantis MDR and ESBL producer in chicken meat, and that further studies on the prevalence of food-borne MDR strains are needed, especially from a One Health perspective. Introduzione: Salmonella spp. è comunemente causa di infezioni gastrointestinali e di focolai di origine alimentare nell’uomo. La principale via di infezione è l'ingestione di cibo o acqua contaminati e S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Typhimurium monofasica, S. Infantis e S. Derby rappresentano sono i cinque sierotipi più comunemente coinvolti nelle infezioni umane. Nell'UE, i controlli microbiologici sugli alimenti effettuati nel contesto del regolamento (CE) n. 2073/2005 hanno rilevato le percentuali più elevate di campioni positivi alla salmonella nei prodotti a base di uova, carne di pollame e prodotti a base di pollame, che risultano essere le maggiori fonti di trasmissione di Salmonella spp. per l'uomo [2]. L'uso eccessivo di antibiotici ha contribuito alla selezione di ceppi di Salmonella MDR (Multi Drug Resistant), resistenti a tre o più classi di antibiotici [3]. La diffusione di Salmonella MDR rappresenta un problema sanitario rilevante, in quanto causa ospedalizzazioni più lunghe, malattie prolungate e tassi di mortalità più elevati [7, 5]. Inoltre il meccanismo di resistenza è potenziato dalla presenza di beta-lattamasi a spettro esteso (ESBL), in grado di idrolizzare penicilline e cefalosporine di prima, seconda e terza generazione. Lo scopo di questo studio è stato quello di individuare i sierotipi di Salmonella spp. presenti in diverse matrici alimentari analizzate nel contesto del regolamento (CE) n. 2073/2005 [2] con particolare riguardo alla diffusione di Salmonella MDR produttore di ESBL. Materiali e metodi: Da gennaio 2019 a dicembre 2021 sono stati analizzati 145 carni di pollame, 106 di maiale, 54 di manzo, 109 molluschi bivalvi, 43 uova e 36 semi germogliati, per un totale di 493 matrici alimentari. L’isolamento di Salmonella spp è stato eseguito secondo la norma ISO 6579-1:2017, i ceppi sono stati identificati mediante saggi biochimici- enzimatici e sierotipizzazione, secondo lo schema Kauffmann - White - Le Minor [6]. Il fenotipo di suscettibilità agli antibiotici è stato determinato mediante il metodo Kirby-Bauer, testando 17 antibiotici appartenenti a 6 classi differenti. L'interpretazione delle zone di inibizione e la classificazione degli isolati come sensibili (S), intermedi (I) o resistenti (R) sono state effettuate secondo le linee guida CLSI [1]. Su 36 ceppi è stata testata la produzione di ESBL mediante Double Disk test (DDT), secondo le linee guida EUCAST [4] e su 19 dei ceppi testati è stata effettuata la caratterizzazione molecolare in PCR per la ricerca dei geni beta-lattamasi produttori. Risultati: Nel triennio 2019-2021, sul totale delle matrici alimentari esaminate, sono stati isolati 67 ceppi di Salmonella spp. (15/172 nel 2019, 17/132 nel 2020 e 35/189 nel 2021); inoltre, nel triennio considerato, sono state riscontrate le seguenti percentuali di isolamento (Figura 1): carne di pollame (40%, 52,9% e 71,4%), carne di maiale (20%, 23,5% e 5,7%), carne bovina (2,9% soltanto nel 2021), molluschi bivalvi (26,7% nel 2020 e 8,6% nel 2021), uova (11,8% soltanto nel 2020) e semi germogliati (13,3%, 11,8%, 11,4%). Tra i vari sierotipi isolati, S. Infantis è stato quello predominante (48%), isolato in 32 campioni di carne di pollame; i sierotipi di S. Typhimurium (9%), S. Derby (6%) e S. Enteritidis (3%) hanno mostrato una bassa prevalenza (Figura 2). Riguardo i profili di antimicrobicoresistenza, 43/67 ceppi testati sono risultati resistenti ad almeno un antibiotico, con percentuali del 31,3% alla kanamicina, 43,2% alle sulfonamidi, 47,7% all'acido nalidixico, 49,2% all'ampicillina e 50,7% alla tetraciclina. Pochi ceppi sono risultati resistenti a levofloxacina (5%) e cloramfenicolo (6%); tutti sono risultati sensibili a imipenem, ciprofloxacina ed enrofloxacina. Un profilo MDR è stato trovato in 36/67 ceppi (54%), che hanno mostrato resistenza a tre (n=4), quattro (n=22) e cinque (n=10) classi di antibiotici. I profili MDR più frequenti sono stati: R ad aminoglicosidi, beta-lattamici, chinolonici, sulfamidici e tetracicline (in 8 S. Infantis, 1 S. Salamae e 1 S. Kentucky) e R a beta-lattamici, chinolonici, sulfamidici e tetracicline (in 9 S. Infantis e 1 S. Cerro). Il DDT ha consentito di rilevare la produzione di ESBL in 19/36 ceppi MDR (53 %) (Figura 3). Tale risultato fenotipico è stato confermato rilevando in tutti i ceppi la presenza dei geni beta-lattamasi risultati, con maggiore frequenza, blaSHV (68.4%) e blaCTX- M (47.3%) Conclusioni: I nostri dati evidenziano come sia elevato il rischio di infezione da Salmonella MDR, in particolare produttore di ESBL, per i consumatori; inoltre confermano quanto raccomandato dall’EFSA rispetto alla necessità di un monitoraggio efficace dell’AMR anche negli alimenti, soprattutto in un’ottica One Health, che riconosce la circolarità della salute umana, animale ed ambientale

Microbial diversity of traditional Sicilian cheeses

In the last years, the microbial characterisation of traditional Sicilian cheeses, such as Caciocavallo Palermitano, Protected Designation of Origin (PDO) Pecorino Siciliano and PDO Vastedda della valle del Belìce have been the object of different studies conducted by our research group. To this purpose, the aim of the present study was to describe the microbial population of traditional Sicilian cheeses.peer-reviewe

Reduction of PDO Pecorino Siciliano cheese making duration: microbial dynamics and quality attributes deriving from replacing whey permeate with hot water during cooking

This work was carried out with the aim to reduce the transformation duration of Protected Designation of Origin (PDO) Pecorino Siciliano cheese. To this purpose, the cooking in hot water (experimental production, EXP) was compared to the traditional cheese cooking under whey permeate (control production, CTR). The microbiological composition of under rind (UR) and core (Co) section of CTR and EXP cheeses was determined by a combined culture-dependent and -independent approach. Total mesophilic microorganisms and lactic acid bacteria (LAB) present in raw ewes' milk (5.0 log CFU/mL) increased during cheese making and reached values of about 8.0 log CFU/g in both sections (UR and Co) of 5-month ripened cheeses of both productions (CTR and EXP) monitored. The identification of the viable LAB populations in ripened cheeses showed that Enterococcus, Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus, Levilactobacillus, Limosilactobacillus and Streptococcus dominated UR and Co sections of all cheeses. MiSeq Illumina analysis demonstrated that LAB populations (lactobacilli, lactococci and streptococci) dominated the bacterial community of cheeses at 95.63-98.41 % of relative abundance. The two different cooking operations did not influence the physicochemical characteristics of PDO Pecorino Siciliano cheeses. Sensory evaluation performed by artificial senses analysis and trained panelists confirmed that the modification of PDO Pecorino Siciliano cheese production protocol did not significantly affect product characteristics and overall acceptance. Thus, data of this work confirmed that cooking under hot water allowed to reduce transformation duration and safeguard typicality of PDO Pecorino Siciliano cheese

Detection of Arcobacter spp. in food products collected from Sicilia region: A preliminary study

The aim of the study was to evaluate the occurrence of Arcobacter spp. in food samples collected from Sicilia region. A total of 91 food products of animal origin (41 meat, 17 fresh milk, 18 shellfish) and 15 samples of fresh vegetables, were examined by cultural method and confirmed by biochemical analysis and PCR methods. The detection of Arcobacter spp. was performed, after selective enrichment, on two selective agar plates: Arcobacter agar and mCCD (modified charcoal cefoperazone deoxycholate) agar supplemented with CAT (Cefoperazone, Amphotericin B and Teicoplanin). Arcobacter species were isolated using the membrane filtration technique. In 13 (14.3%) out of the 91 tested samples, the presence of Arcobacter spp. was found: the isolates were confirmed by multiplex PCR and identified as belonging to the species A. butzleri and A. cryaerophilus. The highest prevalence rate was observed in chicken meat (8.8%) followed by shellfish (3.3%). Negative results have been obtained for raw milks and vegetables samples. The preliminary study highlights the importance of this emerging pathogen and the need for further studies on its prevalence and distribution in different types of food for human consumption

Caratterizzazione molecolare di ceppi di Listeria monocytogenes isolati da matrici alimentari e da fonti umane

Scopo del lavoro è stato la caratterizzazione molecolare di ceppi di L. monocytogenes (L.m.) isolati da alimenti e dall’uomo nel triennio 2019-2021. Un totale di 67 ceppi di L.m. sono stati isolati (norma UNI EN ISO 11290-1:2017) presso i laboratori di Microbiologia degli alimenti dell’IZS Palermo da diverse matrici alimentari con prevalenza di alimenti pronti quali prodotti lattiero-caseari, a base di carne, ittici, vegetali, prelevati nell’ambito dei campionamenti dei Servizi Veterinari delle ASP. Gli isolati batterici sono stati conservati a –20 °C in Microbank ed in seguito inviati al LNR di Teramo per la determinazione del sierogruppo (PCR-Multiplex) e successiva indagine molecolare (MLST e Whole Genome Sequencing -WGS). Il sequenziamento è stato effettuato su piattaforma NextSeq 500 Illumina e l’analisi dei dati eseguita su una piattaforma bioinformatica e di raccolta dati del LNR L.m., denominata GenPat. Presso i laboratori ospedalieri di Palermo (Ospedale Civico, Ospedali Riuniti Villa Sofia-Cervello e Azienda Ospedaliera Universitaria Policlinico, quest’ultimo anche Laboratorio di Riferimento Regionale per la listeriosi) sono stati isolati n. 39 ceppi clinici di L.m. I ceppi, insieme alle schede per la raccolta dei dati epidemiologici, sono stati inviati all’Istituto Superiore di Sanità (ISS-Operational Contact Point microbiologico per L.m.) per la caratterizzazione molecolare mediante WGS. Il sequenziamento è stato effettuato su una piattaforma IonTorrent S5 e l’analisi è stata eseguita automaticamente su una piattaforma bioinformatica e di raccolta dati, denominata IRIDA-ARIES. I risultati sulla caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati dagli alimenti hanno mostrato una prevalenza del sierogruppo IVb (70%), seguito dal IIa (24%), dal IIb (4.5%) e dal IIc (1.5%). Il 46.3% dei ceppi, tutti appartenenti al sierogruppo IVb, sono stati isolati da mozzarella e formaggio a pasta filata, prelevati presso una stessa azienda produttrice, durante controlli ufficiali, nel periodo agosto-settembre 2020, a seguito di positività rilevata in autocontrollo. I risultati del sequenziamento effettuato dal LNR hanno evidenziato l’esistenza di cluster di ceppi appartenenti al Clonal Complex (CC) 2, CC199 e CC1. In particolare, tutti i ceppi isolati nello stesso caseificio, sia nel periodo considerato che in un successivo campionamento a gennaio 2022, appartenevano al CC2 e Sequence Type 2 (ST2). Riguardo i ceppi clinici, l’analisi filogenetica dei genomi dei 39 isolati di L.m. ha consentito l’identificazione di un Cluster_90 composto da 25 ceppi dei quali 6 isolati nel 2019, 16 nel 2020 e 1 nel 2021. I 25 ceppi sono risultati appartenere al sierogruppo IVb, ST2 e CC2 presentando tra loro una differenza allelica al core genome MLST compresa tra 0 e 12. Da sottolineare la presenza di 8 ceppi, isolati tra ottobre 2019 e agosto 2021, associati a casi materno neonatali. Le sequenze genomiche dei 39 ceppi clinici di L.m. sono state confrontate con le sequenze depositate nel database IRIDA-ARIES. Dall’analisi è emerso che al Cluster_90, ST2 appartenevano anche 3 ceppi isolati in Lombardia (2 nel 2019, 1 nel 2020), 2 in Piemonte, 1 nel Lazio, 1 in Toscana nel 2020 e 2 ceppi isolati in Sicilia (1 nel 2019 da Siracusa e 1 nel 2020 dalla provincia di Palermo). Il presente studio ha permesso di avviare la costruzione di una rete integrata medico/veterinaria tra laboratori per potenziare il sistema di sorveglianza della listeriosi nella regione Sicilia