Exon skipping induces uniform dystrophin rescue with dose-dependent restoration of serum miRNA biomarkers and muscle biophysical properties

Therapies that restore dystrophin expression are presumed to correct Duchenne muscular dystrophy (DMD), with antisense-mediated exon skipping being the leading approach. Here we aimed to determine whether exon skipping using a peptide-phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide (PPMO) conjugate results in dose-dependent restoration of uniform dystrophin localization, together with correction of putative DMD serum and muscle biomarkers. Dystrophin-deficient mdx mice were treated with a PPMO (Pip9b2-PMO) designed to induce Dmd exon 23 skipping at single, ascending intravenous doses (3, 6, or 12 mg/kg) and sacrificed 2 weeks later. Dose-dependent exon skipping and dystrophin protein restoration were observed, with dystrophin uniformly distributed at the sarcolemma of corrected myofibers at all doses. Serum microRNA biomarkers (i.e., miR-1a-3p, miR-133a-3p, miR-206-3p, miR-483-3p) and creatinine kinase levels were restored toward wild-type levels after treatment in a dose-dependent manner. All biomarkers were strongly anti-correlated with both exon skipping level and dystrophin expression. Dystrophin rescue was also strongly positively correlated with muscle stiffness (i.e., Young’s modulus) as determined by atomic force microscopy (AFM) nanoindentation assay. These data demonstrate that PPMO-mediated exon skipping generates myofibers with uniform dystrophin expression and that both serum microRNA biomarkers and muscle AFM have potential utility as pharmacodynamic biomarkers of dystrophin restoration therapy in DMD

Dystrophin regulates peripheral circadian SRF signalling

Dystrophin is a sarcolemmal protein essential for muscle contraction and maintenance, absence of which leads to the devastating muscle wasting disease Duchenne muscular dystrophy (DMD)[1, 2]. Dystrophin has an actin-binding domain [3–5], which specifically binds and stabilises filamentous (F)-actin[6], an integral component of the RhoA-actin-serum response factor (SRF)-pathway[7]. The RhoA-actin-SRF-pathway plays an essential role in circadian signalling whereby the hypothalamic suprachiasmatic nucleus, transmits systemic cues to peripheral tissues, activating SRF and transcription of clock target genes[8, 9]. Given dystrophin binds F-actin and disturbed SRF-signalling disrupts clock entrainment, we hypothesised that dystrophin loss causes circadian deficits. Here we show for the first time alterations in the RhoA-actin-SRF-signalling-pathway, in both dystrophin-deficient myotubes and dystrophic mouse models. Specifically, we demonstrate reduced F/G-actin ratios and nuclear MRTF, dysregulation of core clock and downstream target-genes, and down-regulation of key circadian genes in muscle biopsies from DMD patients harbouring an array of mutations. Further, disrupted circadian locomotor behaviour was observed in dystrophic mice indicative of disrupted SCN signalling, and indeed dystrophin protein was absent in the SCN of dystrophic animals. Dystrophin is thus a critically important component of the RhoA-actin-SRF-pathway and a novel mediator of circadian signalling in peripheral tissues, loss of which leads to circadian dysregulation

Role of microRNA-146a in Duchenne muscular dystrophy progression in mice

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) jest chorobą genetyczną prowadzącą do utraty funkcji mięśni szkieletowych, oddechowych oraz mięśnia sercowego. Spowodowana mutacją w genie dystrofiny i w konsekwencji, brakiem funkcjonalnego białka, nieuchronnie prowadzi do przedwczesnej śmierci. Mimo dobrze poznanych przyczyn, przeprowadzone dotychczas próby terapii genowej nie powiodły się. Obecne metody leczenia skupiają się więc, między innymi, na złagodzeniu stanu zapalnego mięśni, który wraz ze zjawiskami obumierania włókien mięśniowych, zaburzeniami regeneracji oraz zwłóknienia tkanki rozpatruje się jako nieodłączny element patofizjologii DMD. MikroRNA (miRNA) są endogennymi, krótkimi, niekodującymi cząsteczkami RNA odgrywającymi rolę w potranskrypcyjnej regulacji genów. Wpływają one na niemal każdy proces komórkowy. Jak pokazały nasze najnowsze badania, mięśnie dystroficzne wykazują znacząco zwiększoną ekspresję miR-146a. Cząsteczka ta bezpośrednio reguluje białko Numb, będące inhibitorem ścieżki przekazu sygnału Notch, która reguluje proliferację i różnicowanie komórek satelitarnych (mSC, ang. muscle satellite cells), stanowiących pulę komórek macierzystych mięśni odpowiadających za regenerację. W modelach komórkowych, zwiększona ekspresja miR-146a wiąże się z inhibicją różnicowania mioblastów. Co więcej, dane literaturowe wskazują na istotną rolę miR-146a w regulacji odpowiedzi zapalnej, jak również zwłóknienia mięśni. W związku z tym, celem przeprowadzonych badań było zbadanie roli miR-146a w rozwoju zaburzeń u myszy dystroficznych mdx, pozbawionych funkcjonalnego białka dystrofiny. Analizy przeprowadzono na materiale zwierzęcym pobranym z czterech genotypów myszy: dzikich (wt/wt), z wyłączoną ekspresją miR-146a (miR-146a KO), myszy mdx oraz myszy dystroficznych pozbawionych ekspresji miR-146a (dKO). Poprawność genotypów potwierdzono analizując ilość transkryptu miR-146a oraz obecność dystrofiny w mięśniu brzuchatym łydki zwierząt. Pod kątem degeneracji włókien mięśniowych nie zauważono zmian wywołanych brakiem ekspresji miR-146a u zwierząt dystroficznych. Dodatkowo, myszy dKO nie wykazały zmian w poziomie nacieku zapalnego oraz ilości tkanki włóknistej w mięśniach szkieletowych w porównaniu z myszami mdx. W kontekście regeneracji, zauważono osłabioną proliferację i różnicowanie aktywowanych mSC dKO w porównaniu z mdx. Efekt ten wydaje się być niezależny od proponowanego mechanizmu, w którym miR-146a wpływa na Numb. Dodatkowo, obniżona ekspresja embrionalnego ciężkiego łańcucha miozyny i miogeniny, oraz zwiększenie ilości transkryptu miR-206 w mięśniach myszy dKO w odniesieniu do mdx, sugerują istnienie mechanizmów kompensacyjnych, które ostatecznie nie pozwoliły na zaobserwowanie różnic w regeneracji wywołanych brakiem miR-146a w mięśniach dystroficznych. Podsumowując, przeprowadzone badania sugerują, że miR-146a nie odgrywa istotnej roli w regulacji procesu degeneracji, stanu zapalnego, regeneracji oraz zwłóknienia mięśni dystroficznych.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic disorder which results in failure of skeletal, respiratory and heart muscles function. Caused by mutations in dystrophin gene and consequent loss of functional protein, DMD inevitably leads to premature death. Despite well-known genetic background, gene therapy trials carried out so far have not been successful. Current treatment focuses on mitigation of muscle inflammation, which, amongst other processes like myofibers degeneration, regeneration failure or muscle fibrosis is an inherent element of DMD pathophysiology. MicroRNAs (miRNA) are a group of small, noncoding RNAs with a role in gene expression regulation at post-transcriptional level. These molecules have the ability to control almost every cellular process. Our recent work shows that expression of miR-146a in dystrophic muscles is significantly elevated. MiR-146a directly regulates Numb protein - an inhibitor of Notch signaling pathway, which regulates muscle satellite cells (mSC, muscle stem cells) proliferation and differentiation. In cellular models, enhanced expression of miR-146a results in inhibition of myoblast differentiation. Moreover, as previously shown, this miRNA is an important regulator of inflammation as well as fibrosis. Therefore, the aim of this study was to check the role of miR-146a in progression of the disease in dystrophic mdx mice. Analysis was performed on material collected from four mice genotypes: wild type (wt/wt), miR-146a knock-out (miR-146a KO), mdx animals and dystrophic mice lacking miR-146a expression (double knock-out, dKO). Animals genotype was confirmed via quantitive analysis of miR-146a transcript and dystrophin presence in Gastrocnemius muscle. Analysis of muscle degeneration showed no significant differences upon miR-146a loss in dystrophic mice. Moreover, dKO mice show significant changes neither in the inflammatory cells infiltration in muscles, nor in the amount of fibrotic tissue, as compared to mdx. For regeneration analysis, weakened proliferation and differentiation of activated mSC seems to be independent of previously proposed interaction with Numb transcript. Moreover, downregulation of embryonic myosin heavy chain and myogenin expression combined with overexpression of miR-206 in dKO muscles in comparison with mdx suggests existence of compensatory mechanisms, which, in the end, did not allow to observe differences in muscle regeneration between dKO and mdx mice.To sum up, conducted studies showed lack of role of miR-146a in the regulation of degeneration, inflammation, regeneration and fibrosis of dystrophic muscle

MicroRNA role in cancer development

Nowotwory są jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Podłoże genetyczne tej choroby to mutacje w komórkach somatycznych, prowadzące do ich transformacji. Wyróżniono specyficzne grupy genów, w których mutacje prowadzą do rozwoju raka. Są to między innymi protoonkogeny oraz geny supresorowe, które odpowiednio promują i hamują wzrost komórki. Co więcej, niepoprawna proliferacja komórek jest również skutkiem zmian epigenetycznych, takich jak hypometylacja destabilizująca genom czy hypermetylacja genów supresorowych. Tradycyjnie, badania nad nowotworami skupiają się na genach kodujących białko, uważanych za główne cząsteczki efektorowe w procesie karcynogenezy. Od momentu odkrycia w 1993 roku grupy małych, niekodujących cząsteczek RNA zwanych mikroRNA, wiedza na temat patogenezy nowotworu znacznie się poszerzyła. MikroRNA są klasą 22 nukleotydowych cząsteczek odgrywających znaczną rolę w regulacji fundamentalnych procesów komórkowych i fizjologicznych. Mechanizm ich działania opiera się na potranskrypcyjnym wyciszaniu genów, między innymi tych odpowiedzialnych za proliferację, różnicowanie i apoptozę komórki. W komórkach nowotworowych obserwowana jest powszechna zmiana ekspresji genów dla mikroRNA, powodowana przez różnorodne mechanizmy, takie jak delecje czy amplifikacje. Cząsteczki te mogą funkcjonować jako onkogeny lub supresory nowotworów, w zależności od funkcji pełnionej przez docelowe mRNA. Co więcej, mikroRNA są częścią wielu molekularnych ścieżek regulowanych przez klasyczne onkogeny i geny supresorowe nowotworów, takie jak MYC, RAS oraz TP53. Dodatkowo onkogenne microRNA kontrolują przebieg cyklu komórkowego poprzez regulację inhibitorów CDK lub represorów transkrypcji z rodziny retinoblastoma, natomiast te funkcjonujące jako supresory nowotworów pośrednio powodują zatrzymanie cyklu. Również geny kodujące modyfikatory epigenetyczne pozostają pod regulacją mikroRNA. Wszelkie zaburzenia ekspresji genów mikroRNA prowadzą do rozregulowania homeostazy komórki i mogą być przyczyną powstawania nowotworu, a modulacja aktywności tych molekuł stanowi możliwość terapeutyczną. Ponadto zastosowanie mikroRNA jako nieinwazyjnych biomarkerów wydaje się mieć ogromny potencjał do wykorzystania w prognozowaniu rozwoju choroby oraz w jej efektywniejszym leczeniu.Cancer is one of the most common cause of death in the world. Genetic bases of this disease are nonlethal mutations in somatic cells, which leads to tumorigenesis. Two main types of genes that play a key role in cancer development are oncogenes and tumor supressor genes which promote and inhibit cell growth, respectively. Moreover, aberrant cell proliferation also may be a consequence of epigenetic mechanisms including hypomethylation which destabilizes DNA or hypermetylation of tumor suppressor genes. Traditionally, cancer studies have focused on protein-coding genes, which are considered as crucial effectors of carcinogenesis. Since the discovery of a new class of small non-coding RNA called microRNA in 1993, the general knowledge of cancer pathogenesis has significantly expanded. MicroRNAs are a family of ̴ 22 nucleotide long RNAs, that play an important role as a regulatory molecules in cells. Action of microRNA is based on mechanisms of posttranscriptional gene silencing including genes involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis. Aberrant expression of microRNA in cancer cells is a rule in most types of cancer. This may occur as a consequence of deletions or amplifications in microRNA genes. These short molecules can function as a novel class of oncogenes or tumor suppressors. What is more, they are commonly accounted for many molecular pathways, which are regulated by classical oncogenes and tumor suppressor genes such as MYC, RAS and TP53. Additionally, oncogenic microRNAs facilitate cell cycle progression by negative regulation of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors or transcription repressors of the retinoblastoma family and tumor suppressor microRNA indirectly induce cell cycle arrest. Furthermore, some microRNAs targets are genes which encode epigenetic modificators. Ubiquitous, aberrant expression of microRNA genes leads to deregulation of cell homeostasis and may contribute to development of cancer. What is more, their tremendous potential as non-invasive biomarkers for diagnosis, prognosis and therapy of cancers has been shown

Connections between Transcription Downstream of Genes and cis-SAGe Chimeric RNA

cis-Splicing between adjacent genes (cis-SAGe) is being recognized as one way to produce chimeric fusion RNAs. However, its detail mechanism is not clear. Recent study revealed induction of transcriptions downstream of genes (DoGs) under osmotic stress. Here, we investigated the influence of osmotic stress on cis-SAGe chimeric RNAs and their connection to DoGs. We found, the absence of induction of at least some cis-SAGe fusions and/or their corresponding DoGs at early time point(s). In fact, these DoGs and their cis-SAGe fusions are inversely correlated. This negative correlation was changed to positive at a later time point. These results suggest a direct competition between the two categories of transcripts when total pool of readthrough transcripts is limited at an early time point. At a later time point, DoGs and corresponding cis-SAGe fusions are both induced, indicating that total readthrough transcripts become more abundant. Finally, we observed overall enhancement of cis-SAGe chimeric RNAs in KCl-treated samples by RNA-Seq analysis

Non-uniform dystrophin re-expression after CRISPR-mediated exon excision in the dystrophin/utrophin double-knockout mouse model of DMD

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most prevalent inherited myopathy affecting children, caused by genetic loss of the gene encoding the dystrophin protein. Here we have investigated the use of the Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 system and a double-cut strategy, delivered using a pair of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors, for dystrophin restoration in the severely affected dystrophin/utrophin double-knockout (dKO) mouse. Single guide RNAs were designed to excise Dmd exon 23, with flanking intronic regions repaired by non-homologous end joining. Exon 23 deletion was confirmed at the DNA level by PCR and Sanger sequencing, and at the RNA level by RT-qPCR. Restoration of dystrophin protein expression was demonstrated by western blot and immunofluorescence staining in mice treated via either intraperitoneal or intravenous routes of delivery. Dystrophin restoration was most effective in the diaphragm, where a maximum of 5.7% of wild-type dystrophin expression was observed. CRISPR treatment was insufficient to extend lifespan in the dKO mouse, and dystrophin was expressed in a within-fiber patchy manner in skeletal muscle tissues. Further analysis revealed a plethora of non-productive DNA repair events, including AAV genome integration at the CRISPR cut sites. This study highlights potential challenges for the successful development of CRISPR therapies in the context of DMD

Targeting the 5' untranslated region of SMN2 as a therapeutic strategy for spinal muscular atrophy

Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disorder caused by mutations in the survival motor neuron 1 (SMN2) gene. All patients have at least one copy of a paralog, SMN2, but a C-to-T transition in this gene results in exon 7 skipping in a majority of transcripts. Approved treatment for SMA involves promoting exon 7 inclusion in the SMN2 transcript or increasing the amount of full-length SMN by gene replacement with a viral vector. Increasing the pool of SMN2 transcripts and increasing their translational efficiency can be used to enhance splice correction. We sought to determine whether the 5' untranslated region (5' UTR) of SMN2 contains a repressive feature that can be targeted to increase SMN levels. We found that antisense oligonucleotides (ASOs) complementary to the 5' end of SMN2 increase SMN mRNA and protein levels and that this effect is due to inhibition of SMN2 mRNA decay. Moreover, use of the 5' UTR ASO in combination with a splice-switching oligonucleotide (SSO) increases SMN levels above those attained with the SSO alone. Our results add to the current understanding of SMN regulation and point toward a new therapeutic target for SMA