Clarithromycin Enhances the Antibacterial Activity and Wound Healing Capacity in Type 2 Diabetes Mellitus by Increasing LL-37 Load on Neutrophil Extracellular Traps

Background: Type 2 diabetes mellitus (T2D) is characterized by susceptibility to bacterial infections and impaired wound healing. Neutrophil extracellular traps (NETs) and the cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 have been implicated both in defense against bacterial infections and in wound healing process. Recently, it was shown that macrolide antibiotic clarithromycin induces the release of LL-37-bearing NETs. In T2D there has not been identified any link between NETs and LL-37 and the effect of clarithromycin in neutrophils/NETs is unknown yet.Methods: Peripheral blood neutrophils were obtained from treatment-naive hyperglycemic T2D patients (naive), normoglycemic T2D patients under antidiabetic treatment (well-controlled) and healthy donors (controls). NET release and NET proteins were studied. Co-culture systems of NET structures with E. coli NCTC 9001 and primary skin fibroblasts were deployed to examine the in vitro antibacterial and fibrotic NET properties, respectively. The effect of clarithromycin was also investigated. Analysis was performed using immunofluorescence confocal microscopy, myeloperoxidase-DNA complex and LL-37 ELISA, immunoblotting and qRT-PCR.Results: NETs were characterized by the presence of LL-37, however they lacked antibacterial activity, in both groups of T2D patients. Clarithromycin significantly increased the externalization of LL-37 on NETs generated from well-controlled T2D neutrophils, thus restoring NET antibacterial capacity and promoting the wound healing process via fibroblast activation and differentiation.Conclusion: This study suggests that clarithromycin may add further advantage to well-controlled T2D patients, by enhancing their antibacterial defense and improving wound healing capacity of fibroblasts, through upregulation of LL-37 on NET structures

Interplay between inflammation and proteases of the blood coagulation cascade

Fibrosis is a common pathological situation that affects several organs. It constitutes the anatomical basis for different disorders and is responsible for increased mortality in all modern societies. The coagulation system is actively involved in several fibrotic models through the production of thrombin. Activation of protease-activator receptor-1 signaling (PAR-1), by thrombin, has been implicated in the pathogenesis of several inflammatory disorders and cancer as well. Moreover, the cross-talk between inflammation and activation of the extrinsic coagulation cascade has been described in a number of disease models. It is well accepted that the myofibroblast is a key cell for the connective tissue remodeling, since it takes place in wound healing process and fibrosis development. Moreover, according to previous studies, ET-1 induces the formation and activation of myofibroblast suggesting a role for this mediator in fibrotic process. Hence, in order to study the cross-talk between inflammation and fibrosis mediated by the extrinsic coagulation system, we used the pulmonary fibrotic disease, bronchopulmonary dysplasia (BPD) as a model. The involvement of cross-talk between the tissue factor – thrombin axis and endothelin 1 signaling was studied in systemic sclerosis (SSc). BPD is a life-threatening fibrotic disorder in infants which rapidly progresses toward fibrosis. Previous studies have established the key role of neutrophils, present in the alveolar microenvironment of infants with BPD, in the excessive inflammatory response. Given the involvement of the extrinsic coagulation cascade in animal models of lung fibrosis, we examined its role in BPD. To evaluate the involvement of coagulation in the fibrotic process, primary human colonic myofibroblasts (HCMFs) were treated with BALF supernatants from infants with BPD. These human colonic myofibroblasts demonstrate an enhanced C5a- and thrombin-dependent migration. Moreover, they express TF in an endothelin-1–dependent manner, with subsequent activation of the extrinsic coagulation cascade and CTGF production mediated by PAR-1 signaling. It is important to note that the majority of this set of experiments was performed in human colonic myofibroblasts (HCMFs), because of abundance of cells, whereas some key experiments were further reproduced in lung myofibroblasts. These findings propose a novel role for ET-1 in fibrosis and suggest a mechanism for the amplification of thrombin generation. Molecules able to neutralize the mediators of this process may provide clinical benefits by breaking the vicious cycle. Afterwards, we focused on SSc, a connective tissue disease. SSc affects the skin and the internal organs. The hallmarks of the disease are activation of immune cells, vascular injury, and excessive accumulation of extracellular matrix in skin and affected organs. Given the previously reported activation of the coagulation system in SSc and the efficacy of Bosentan in the reduction of skin fibrosis in SSc, we studied the implication of TF and ET-1 signaling in HCMFs from SSc patients. The experimental procedure was performed in HCMFs from patients with SSc and from control subjects. HCMFs from SSc patients demonstrate increased levels of CCN2, collagen production and migration rate. In addition, increased TF expression is also observed in SSc HCMFs resulting in thrombin generation. Furthermore, we have demonstrated that thrombin induces ETA expression, while ET-1signaling is implicated in the enhanced TF expression of SSc HCMFs. Inhibition of ET-1 signaling by bosentan abolished the TF-mediated fibrotic capacity of HCMFs. The above findings suggest that targeting the extrinsic coagulation system or ET-1 signaling may reduce the risk of fibrotic complications in SSc. In an attempt to elucidate the precise role of neutrophils in fibrotic process, we studied whether neutrophil extracellular traps (NETs) are implicated in this process. NETs are involved in several inflammatory phenotypes, such as inflammation, autoimmunity, thrombosis and cancer. Moreover, it has been demonstrated that neutrophils release NETs under inflammatory stimuli and are involved in several pulmonary disorders. To investigate the precise role of NETs in the fibrotic process, fibrosis-related agents (cigarette smoke, magnesium silicate and bleomycin) or generic NET inducers (PMA) are used. The aforementioned agents are involved in several fibrotic models, characterized by focal inflammation and neutropilic infiltration; however, their precise role in fibrosis is still obscure. CSE, magnesium silicate or bleomycin had in vitro either absence of direct fibrotic induction or LFs were led on apoptosis. NETs structures released by the aforementioned fibrotic agents or non- fibrotic stimuli, such as PMA, induced activation of LFs and differentiation into myofibroblasts. Myofibroblasts demonstrated increased CCN2 expression, collagen production and wound healing, which were depended on NET structures as observed by direct inhibition of chromatin or histones. Moreover, the orchestration of NET release was autophagy driven as confirmed by specific inhibition studies. Interestingly, IL-17 (a primary initiator of inflammation/fibrosis) was expressed in NETs and promoted the fibrotic activity of differentiated LFs but not their differentiation. The above findings were further supported by immunostaining of human fibrotic lung, where traces of NETs were detected in fibrotic lesions, consisting of extracellular neutrophilic elastase surrounding a-SMA expressing fibroblasts.Η ίνωση είναι μια αρκετά κοινή παθολογική κατάσταση, η οποία προσβάλει διάφορα όργανα και ιστούς. Αποτελεί την ανατομική βάση πολλών ασθενειών και είναι υπεύθυνη για αυξημένη θνησιμότητα σε όλες τις σύγχρονες κοινωνίες. Το εξωγενές σύστημα πήξης εμπλέκεται σε καταστάσεις ίνωσης μέσω της παραγωγής θρομβίνης. Η σηματοδότηση της θρομβίνης μέσω του PAR-1 υποδοχέα διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια των φλεγμονωδών νοσημάτων και του καρκίνου. Παράλληλα, η συνομιλία μεταξύ φλεγμονής και εξωγενούς συστήματος πήξης έχει περιγραφεί σε αρκετά μοντέλα νόσων. Σημαντικό ρόλο στην ίνωση διαδραματίζουν οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες (μυοϊνοβλάστες), ενώ η ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ-1) επάγει το σχηματισμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων. Έτσι, για τη μελέτη του μηχανισμού της ίνωσης, έχοντας ως άξονα τη φλεγμονή και το εξωγενές σύστημα πήξης, επιλέχθηκε το μοντέλο της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας (BPD) σε νεογνά και το μοντέλο του συστηματικού σκληροδέρματος (SSc). Το BPD είναι μία ινωτική διαταραχή απειλητική για τη ζωή του νεογνού, η οποία εξελίσσεται ταχύτατα. Τα ουδετερόφιλα, που ανιχνεύονται στο κυψελιδικό μικροπεριβάλλον των νεογνών με BPD φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις της νόσου. Με βάση τα προηγούμενα ευρήματα του Εργαστηρίου Μοριακής Αιματολογίας σε σχέση με το μοντέλο της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας και τη συμμετοχή του εξωγενούς συστήματος πήξης σε ζωικά μοντέλα πνευμονικής ίνωσης, διερευνήσαμε το ρόλο του εξωγενούς συστήματος πήξης στις ινωτικές εκδηλώσεις της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας των νεογνών. Οι μυοϊνοβλάστες αποτέλεσαν τον κυτταρικό πληθυσμό-στόχο, ενώ το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με BPD αποτέλεσε το βασικό διεγέρτη όλων των πειραμάτων (case group). Ως control group χρησιμοποιήθηκε το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (RDS). Μυοϊνοβλάστες εντέρου από υγιή δότη χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα αυτού του μοντέλου, ενώ τα πιο κρίσιμα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε επαναληπτικές δοκιμασίες με τη χρήση μυοϊνοβλαστών πνεύμονα. Διαπιστώθηκε ότι οι μυοϊνοβλάστες που επωάστηκαν με το υπερκείμενο του BALF από νεογνά με BPD εμφανίζουν αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης, η οποία εξαρτάται από την αναφυλατοξίνη C5a και τη θρομβίνη. Επιπλέον, οι μυοϊνοβλάστες εκφράζουν ιστικό παράγοντα (TF), με τρόπο που ρυθμίζεται από την ενδοθηλίνη-1 και κατόπιν παράγουν αυξητικό παράγοντα συνδετικού ιστού (CCN2), μέσω PAR-1 σηματοδότησης. Στη συνέχεια, η μελέτη μας στράφηκε στη νόσο του συστηματικού σκληροδέρματος. Το SSc είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα, το οποίο προσβάλλει το δέρμα καθώς και εσωτερικά όργανα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού, η αγγειακή βλάβη και η υπέρμετρη εναπόθεση ινώδους συνδετικού ιστού στα προσβαλλόμενα όργανα αποτελούν τα πιο βασικά χαρακτηριστικά της νόσου. Καθώς το εξωγενές σύστημα πήξης ενεργοποιείται στη συγκεκριμένη νόσο και η χορήγηση Βosentan περιορίζει σημαντικά την ίνωση του δέρματος των ασθενών με SSc, διερευνήσαμε τη συνομιλία μεταξύ του άξονα TF-θρομβίνης και της σηματοδότησης της ενδοθηλίνης-1 στην ινωτική δραστηριότητα που παρατηρείται στη νόσο. Ειδικότερα, μελετήσαμε τις ιδιότητες, τη συμπεριφορά και την εμπλοκή των μυοϊνοβλαστών στη νόσο του συστηματικού σκληροδέρματος. Πραγματοποιήσαμε μία σειρά πειραμάτων στα οποία συμμετείχαν μυοϊνοβλάστες από ασθενείς με σκληρόδερμα (SSc HCMFs-case group) και μυοϊνοβλάστες από υγιείς δότες (Control HCMFs-control group). Παρατηρήσαμε ότι οι μυοϊνοβλάστες των ασθενών με SSc εμφανίζουν αυξημένη παραγωγή CCN2, κολλαγόνου και αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα. Η συμπεριφορά τους αυτή εξαρτάται άμεσα από τη θρομβίνη. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μυοϊνοβλάστες των ασθενών έχουν αυξημένη έκφραση TF. Διαπιστώσαμε ότι η ενεργοποίηση του εξωγενούς συστήματος πήξης αυξάνει την έκφραση του υποδοχέα Α της ενδοθηλίνης (ETA), η οποία εξαρτάται από τη θρομβίνη. Η υπερ-έκφραση του ETA συμβάλλει σε περαιτέρω αύξηση τόσο της έκφρασης του TF όσο και της ινωτικής δραστηριότητας των μυοϊνοβλαστών. Η χορήγηση του Bosentan, που δρα ανασταλτικά στη σηματοδότηση της ενδοθηλίνης-1, αναστέλλει σημαντικά την ινωτική δραστηριότητα των μυοϊνοβλαστών, η οποία είναι εξαρτώμενη από τον TF. Συνοψίζοντας, τόσο το εξωγενές σύστημα της πήξης όσο και η ET-1 συμμετέχουν καθοριστικά στις ινωτικές εκδηλώσεις του BPD και του SSc. Παράλληλα, υποδεικνύουν νέους θεραπευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση των ινωτικών επιπλοκών των νόσων. Λαμβάνοντας τα αποτελέσματα σχετικά με το ρόλο της ίνωσης από τα προαναφερθέντα μοντέλα, το ενδιαφέρον μας στράφηκε στη διερεύνηση του ρόλου των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης (ΝΕΤs) στην ινωτική διαδικασία. Μελέτες του Εργαστηρίου Μοριακής Αιματολογίας και πολυάριθμα δεδομένα από άλλα ερευνητικά κέντρα υπέδειξαν τη συμμετοχή των NETs στη φλεγμονή, στην αυτοανοσία, στην αντιγονοπαρουσίαση και στον καρκίνο. Για να μελετηθεί η συμμετοχή των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης στην ινωτική διαδικασία χρησιμοποιήθηκαν παράγοντες που σχετίζονται με την ίνωση (όπως είναι το εκχύλισμα τσιγάρων καπνού (CSE), το πυρητικό μαγνήσιο και η μπλεομυκίνη), αλλά και μη ινωτικά μόρια (όπως είναι το PMA). To CSE, το πυρητικό μαγνήσιο και η μπλεομυκίνη σχετίζονται με διάφορα μοντέλα ίνωσης, στα οποία τα ουδετερόφιλα συμμετέχουν καθοριστικά. Ωστόσο ο μηχανισμός εκδήλωσής της ίνωσης παρουσία αυτών των παραγόντων αλλά και η συμμετοχή των ουδετεροφίλων στην εκδήλωσή της παραμένει ασαφής. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης, διαπιστώθηκε ότι τα ινωτικά μόρια δεν επάγουν την ινωτική διαδικασία όταν παρέχονται άμεσα στου ινοβλάστες. Αντίθετα, τα ουδετερόφιλα από υγιείς δότες σχηματίζουν εξωκυττάρια ουδετεροφιλικά δίκτυα χρωματίνης ύστερα από επώαση με τους ινωτικούς παράγοντες. Διαπιστώθηκε μάλιστα ότι ο σχηματισμός των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης εξαρτάται από την αυτοφαγία και την κιτρουλινοποίηση των ιστονών. Επιπλέον, οι ινοβλάστες που επωάζονται με τις δομές των ουδετεροφίλων [οι οποίες σχηματίζονται είτε από τα παραπάνω ινωτικά μόρια είτε από μη-ινωτικούς διεγέρτες (ΡΜΑ)], ενεργοποιούνται, διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες (ενεργοποιημένοι ινοβλάστες) και εκδηλώνουν ινωτική συμπεριφορά. Η συμμετοχή των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης στη διαφοροποίηση/ενεργοποίηση των ινοβλαστών διαπιστώθηκε με ειδική αναστολή της χρωματίνης και των ιστονών, με τη χρήση DNase I και ηπαρίνης αντίστοιχα. Επιπλέον, η IL-17, η οποία αποτελεί εναρκτήριο μόριο της φλεγμονής/ίνωσης, εντοπίστηκε πάνω στα ΝΕΤs που απελευθερώνονται παρουσία αυτών των ινωτικών ή μη παραγόντων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι IL-17 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ινωτική συμπεριφορά των ήδη διαφοροποιημένων ινοβλαστών (μυοϊνοβλάστες). Tα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ανθρώπινο πνευμονικό ιστό με (εκτεταμένη) ίνωση, όπου εντοπίστηκαν εξωκυττάρια δίκτυα χρωματίνης σε εστίες με ίνωση και σε εγγύς θέσεις με ενεργοποιημένους ινοβλάστες. Τα ευρήματα αυτά φανερώνουν τον καθοριστικό ρόλο των ουδετεροφίλων στο μηχανισμό της ίνωσης και παρέχουν αρκετά σημεία για θεραπευτικές παρεμβάσεις

Methods for the Assessment of NET Formation: From Neutrophil Biology to Translational Research

Several studies have indicated that a neutrophil extracellular trap (NET) formation, apart from its role in host defense, can contribute to or drive pathogenesis in a wide range of inflammatory and thrombotic disorders. Therefore, NETs may serve as a therapeutic target or/and a diagnostic tool. Here, we compare the most commonly used techniques for the assessment of NET formation. Furthermore, we review recent data from the literature on the application of basic laboratory tools for detecting NET release and discuss the challenges and the advantages of these strategies in NET evaluation. Taken together, we provide some important insights into the qualitative and quantitative molecular analysis of NETs in translational medicine today

Autophagy Mediates the Delivery of Thrombogenic Tissue Factor to Neutrophil Extracellular Traps in Human Sepsis

Background: Sepsis is associated with systemic inflammatory responses and induction of coagulation system. Neutrophil extracellular traps (NETs) constitute an antimicrobial mechanism, recently implicated in thrombosis via platelet entrapment and aggregation. Methodology/Principal Findings: In this study, we demonstrate for the first time the localization of thrombogenic tissue factor (TF) in NETs released by neutrophils derived from patients with gram-negative sepsis and normal neutrophils treated with either serum from septic patients or inflammatory mediators involved in the pathogenesis of sepsis. Localization of TF in acidified autophagosomes was observed during this process, as indicated by positive LC3B and LysoTracker staining. Moreover, phosphatidylinositol 3-kinase inhibition with 3-MA or inhibition of endosomal acidification with bafilomycin A1 hindered the release of TF-bearing NETs. TF present in NETs induced thrombin generation in culture supernatants, which further resulted in protease activated receptor-1 signaling. Conclusions/Significance: This study demonstrates the involvement of autophagic machinery in the extracellular delivery of TF in NETs and the subsequent activation of coagulation cascade, providing evidence for the implication of this process in coagulopathy and inflammatory response in sepsis. © 2012 Kambas et al

Serum granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is increased in patients with active radiographic axial spondyloarthritis and persists despite anti-TNF treatment

$\bf Background:$ Accumulating evidence supports the role of monocytes and neutrophils in radiographic axSpA (r-axSpA). Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is a growth factor for both leukocyte lineages and a pro-inflammatory cytokine activating myeloid cells and promoting osteoclastogenesis. It acts through the JAK-STAT pathway. We measured serum GM-CSF and markers of bone metabolism in patients with r-axSpA before and after anti-TNF treatment. $\bf Methods:$ Patients with active r-axSpA despite treatment with NSAIDs, all eligible for treatment with a biologic agent, were recruited. Healthy donors were sampled as controls. Serum was collected before (baseline) and after 4–6 months (follow-up) of anti-TNF treatment and the following molecules were measured with ELISA: GM-CSF, sclerostin (SOST), and dickkopf-1 (Dkk-1). $\bf Results:$ Twelve r-axSpA patients (7 males, 5 females, median age 37 years) with a median disease duration of 1 year and 16 age- and sex-matched controls were included. At baseline, patients had mean BASDAI 6.3$\pm$2 and ASDAS 3.2$\pm$0.7, which decreased to 4.1$\pm$1.7 and 2.2$\pm$0.6 at follow-up, respectively. At baseline, r-axSpA patients had significantly higher mean serum levels of GM-CSF (150 vs 62pg/ml, $\it p$=0.049), significantly lower Dkk-1 (1228 vs 3052pg/ml, $\it p$=0.001), but similar levels of SOST (369 vs 544pg/ml, $\it p$=0.144) compared to controls. Anti-TNF treatment did not affect GM-CSF, Dkk-1, or SOST levels. Spearman correlation analysis showed that GM-CSF correlated positively with ASDAS at baseline ($\it r$=0.61, $\it p$=0.039), while no correlations were identified between bone markers (Dkk-1, SOST) on one hand and GM-CSF or disease activity indices on the other. $\bf Conclusions:$ GM-CSF is increased in patients with active AS and strongly correlates with disease activity. TNF inhibition does not affect GM-SCF levels, despite improving disease activity. GM-CSF may represent an important pathway responsible for residual inflammation during TNF blockade, but also a potential target of JAK inhibitors, explaining their efficacy in r-axSpA

Neutrophil extracellular traps regulate IL-1 beta-mediated inflammation in familial Mediterranean fever

Objective Inflammatory attacks of familial Mediterranean fever (FMF) are characterised by circulation and influx of high number of polymorphonuclear neutrophils (PMN) in the affected sites and profound therapeutic effect of IL-1 beta inhibitors. We investigated the role of neutrophil extracellular traps (NET) in the pathogenesis of FMF, and their involvement in IL-1 beta production. Methods Blood samples were obtained from six FMF patients during remissions and from three patients during attacks. NET formation and NET components were studied by fluorescence techniques, immunobloting and MPO-DNA complex ELISA. Results PMNs from patients released NETs decorated with IL-1 beta during disease attacks. On the other hand, PMNs from patients during remission were resistant to inflammatory stimuli that induce NET release in PMNs from control subjects. Lower basal autophagy levels were identified in PMNs during remission, while induction of autophagy facilitated NET release, suggesting that autophagy is involved in the regulation of NET release. During the resolution of attacks, inhibition of NET formation by negative feedback mechanism was also observed. The anti-inflammatory agents, colchicine and DNAse I, inhibited IL-1 beta production in PMNs and IL-1 beta activity in NETs, respectively. Conclusions We suggest two additive events for triggering the FMF attack; the production of IL-1 beta by PMNs and its release through NETs. At the same time NETs, homeostatically, downregulate further NETosis, facilitating the resolution of attack. Compensatorly, lower basal autophagy of PMNs may protect from crises by attenuating the release of pro-inflammatory NETs

Autophagy Mediates the Delivery of Thrombogenic Tissue Factor to Neutrophil Extracellular Traps in Human Sepsis

<div><h3>Background</h3><p>Sepsis is associated with systemic inflammatory responses and induction of coagulation system. Neutrophil extracellular traps (NETs) constitute an antimicrobial mechanism, recently implicated in thrombosis <em>via</em> platelet entrapment and aggregation.</p> <h3>Methodology/Principal Findings</h3><p>In this study, we demonstrate for the first time the localization of thrombogenic tissue factor (TF) in NETs released by neutrophils derived from patients with gram-negative sepsis and normal neutrophils treated with either serum from septic patients or inflammatory mediators involved in the pathogenesis of sepsis. Localization of TF in acidified autophagosomes was observed during this process, as indicated by positive LC3B and LysoTracker staining. Moreover, phosphatidylinositol 3-kinase inhibition with 3-MA or inhibition of endosomal acidification with bafilomycin A1 hindered the release of TF-bearing NETs. TF present in NETs induced thrombin generation in culture supernatants, which further resulted in protease activated receptor-1 signaling.</p> <h3>Conclusions/Significance</h3><p>This study demonstrates the involvement of autophagic machinery in the extracellular delivery of TF in NETs and the subsequent activation of coagulation cascade, providing evidence for the implication of this process in coagulopathy and inflammatory response in sepsis.</p> </div