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Einzelmolekül-Experimente mit mitotischen Motorproteinen
Die vorliegende kumulative Doktorarbeit
beinhaltet in fünf Kapiteln (Kapitel 2, 3, 4, und 5 bestehend aus
publizierten Veröffentlichungen und Kapitel 6 bestehend aus einem
eingereichten Manuskript) neue Erkenntnisse über unterschiedlicher
Aspekte der Regulation von mitotischen kinesin-5 Motorproteinen.
Außerhalb des Themas der kinesin-5-Regulation besteht Kapitel 7 aus
einer publizierten Veröffentlichung über zellulare Motilität
neuronaler Rezeptoren, zu der ich in vivo Messungen in Neuronen
mittels TIRF-Mikroskopie beigetragen habe. In Kapitel 2 wurden
Faktoren untersucht, die Richtungsänderungen in Cin8 - eines der
zwei kinesin-5 Motorproteine in Saccharomyces cerevisiae -
verursachen. Bisher wurde angenommen, dass Motorproteinen eine
bestimmte, feste Bewegungsrichtung durch ihre Molekularstruktur
vorgegeben ist. Die gerichtete Bewegung von kinesin-5 erfolgt nach
bisherigem Kenntnisstand stets und unidirektional in Richtung des
Plus-Endes des Mikrotubulus (MT). Die hier präsentierten Ergebnisse
und die von dieser Arbeit unabhängigen, zeitgleich veröffentlichen
Daten einer aktuellen Studie von Roostalu et al. zeigten jetzt
allerdings, dass Cin8 wider Erwarten in der Lage ist seine
Bewegungsrichtung zu ändern. In der vorliegenden Studie wurde die
Direktionalität von Cin8 in vitro mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz
in Motilitätsexperimenten und in vivo mittels live-cell-Mikroskopie
untersucht. Die in-vitro-Experimente zeigten, dass die
Bewegungsrichtung einzelner Cin8 Motorproteine entlang eines MT
durch Verringerung der Ionenstärke im Puffer von schneller,
prozessiver zum Minus-Ende gerichteter Bewegung zu langsamer zum
Plus-Ende gerichteter Bewegung „umgeschaltet“ werden konnte.
Hinweise auf einen physiologisch relevanteren
Regulationsmechanismus gab das interessante Ergebnis, dass die
Motilität von Cin8 stark durch die Bindung eines zweiten MT
beeinflusst wurde: in Puffer mit hoher Ionenstärke bewegte sich
Cin8 schnell und prozessiv in Richtung Minus-Ende eines einzelnen
MT und änderte seine Motilität schlagartig hin zu schnell
alternierender Direktionalität sobald ein zweiter, antiparalleler
MT gebunden wurde. Die Motilität mit alternierender Direktionalität
bewirkte gleichzeitig eine gleichmäßige relative Verschiebung des
zweiten MT in Richtung Plus-Ende. Dieses außergewöhnliche Verhalten
von Cin8 könnte bei der Regulation seiner unterschiedlichen
Funktionen in der mitotischen Spindel eine entscheidende Rolle
spielen. In Kapitel 3 wurde durch Einzelmolekül-Fluoreszenz
in-vitro-Experimente bestätigt, dass bei niedriger Ionenstärke
einzelne Cin8 Moleküle in der Lage sind, ihre Motilität
bidirektional umzuschalten. Mittels Intensitätsanalyse der
Kymographen von GFP-markierten Cin8 Motorproteinen in
Niedrigsalzpuffer konnte die von Roostalu et al. postulierte
Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass Cluster-Formation der Cin8
Moleküle notwendig ist, um Motilität in Richtung Plus-Ende zu
initiieren. Die Ergebnisse bekräftigen die These, dass die
Direktionalität einzelner Cin8 Moleküle durch die Bindung von
Ladung reguliert wird und nicht durch mechanische Kopplung zwischen
zwei oder mehreren Motorproteinen. In Kapitel 4 wurde der Einfluss
des kinesin-5-Inhibitor-Moleküls Monastrol auf die Motordomäne von
kinesin-5 aus Xenopus laevis (Eg5) untersucht. Für diese Studie
wurde eine stabile, dimere kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaere
(Eg5Kin) konstruiert, die aus der Motordomäne und der
neck-linker-Region von Eg5 und der neck-coiled-coil-Region von
Drosophila melanogaster kinesin-1 (DmKHC) besteht. In
Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten zeigte diese Chimaere - im
Gegensatz zu Wildtyp Eg5 - eine hohe Prozessivität und keinerlei
diffusive Moden in ihrer Motilität. Die Zugabe des Eg5-Inhibitors
Monastrol zu dem Einzelmolekül-Experiment führte zu einer Reduktion
der Länge der prozessiven Läufe, beeinflusste aber
überraschenderweise nicht die Geschwindigkeit von Eg5Kin. Eine
Reihe von Experimenten mit sukzessiv zunehmender
Monastrol-Konzentration ließ schließlich den Schluss zu, dass die
Bindung eines einzelnen Monastrol-Moleküls an ein Eg5Kin-Dimer
nicht ausreicht, um dessen prozessiven Lauf zu stoppen, sondern
dass die simultane Bindung von zwei Monastrol-Molekülen nötig ist,
um das Dimer zu inhibieren, d.h. seinen Lauf zu stoppen. In Kapitel
5 wurde der Einfluss der neck-linker-Länge auf die prozessive
Motilität von zwölf dimeren kinesin-1 stalk/kinesin-5 head
Chimaeren, die auf Eg5Kin basieren, untersucht. Bei diesen
Motorprotein-Konstrukten wurde die neck-linker-Länge variiert und
reichte von 9 Aminosäuren (AS) über die nativen 18 AS bis hin zu 21
AS des Wildtyp Eg5 neck-linker. Bei einer weiteren Chimaere wurden
3 Proline zu den nativen 18 AS von Eg5 hinzugefügt, um eine
artifizielle neck-linker-Verlängerung zu erzeugen. Mittels
Multi-Motor-Gleit-Experimenten mit TMR-markierten MTs wurde
zunächst bestätigt, dass alle Konstrukte aktive Motorproteine sind.
Mit Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten und mit Experimenten in
einer optischen Falle wurden die Konstrukte auf Einzelmolekül-Level
bezüglich Geschwindigkeit, Lauflänge und Kraft getestet. Die
Experimente zeigten, dass weder die Geschwindigkeit noch die
erzeugte Kraft von der neck-linker-Länge abhing. Doch
interessanterweise hatte die neck-linker-Länge einen deutlichen
Einfluss auf die Lauflänge der unterschiedlichen Konstrukte: die
neck-linker-Länge nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 (17
und 18 AS) ermöglichte Lauflängen, die zwei Mal so lang waren wie
die der Konstrukte mit 13 bis 16 AS. Um zu überprüfen ob nahe der
nativen neck-linker-Länge von Eg5 tatsächlich maximale Lauflängen
erzielt werden, wurden Konstrukte mit noch längeren
neck-linker-Längen (19 bis 21 AS) untersucht. Hierbei wurde in der
Tat eine Abnahme der Lauflänge mit Zunahme der neck-linker-Länge
festgestellt. Diese Ergebnisse stellen das kürzlich von Shastry et
al. postulierte einfache und generelle Model, in dem eine kurze
neck-linker-Länge zu der direktesten Kommunikation zwischen den
Motordomänen und damit zu den längsten Lauflängen führt, in Frage.
Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass unterschiedliche
kinesine mit unterschiedlichen Funktionen möglicherweise auch auf
unterschiedliche neck-linker-Längen optimiert sind. In Kapitel 6
wurde mittels einer tetrameren kinesin-1 head/kinesin-5 tail
Chimaere das Umschalten zwischen diffusiver und prozessiver
Motilität untersucht. Bei diesem chimaeren Motorprotein-Konstrukt
(DK4mer) wurde die Motordomäne von Xenopus l. Eg5 durch die
entsprechenden Teile von Drosophila m. kinesin-1 ersetzt, wodurch
ein schnelles, prozessives und MT-gleitendes Motorprotein erzeugt
wurde. Da in früheren Studien von Kapitein et al. gezeigt wurde,
dass die Motilität von Wildtyp Eg5 aus einer Kombination von
diffusiven und prozessiven Moden besteht, war das Ziel dieser
Studie, das Umschalten von diffusiver zu prozessiver Motilität
genauer zu untersuchen. Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente
zeigten, dass DK4mer sich in vitro entlang einzelner MTs schnell
und prozessive bewegt, wobei diese Bewegung durch diffusive Pausen
unterbrochen wurde. Wenn kein ATP im Motilitätspuffer enthalten
war, diffundierte DK4mer - ähnlich wie Eg5 - entlang eines
einzelnen MT. MT-Gleit-Experimenten zeigten, dass DK4mer in der
Lage war antiparallele MTs auseinander zu schieben, und bestätigten
damit, dass DK4mer ein vollfunktionales Tetramer ist. Im Vergleich
zu Eg5 waren bei DK4mer klare Unterschiede zwischen diffusiven und
prozessiven Motilitätsmoden zu erkennen, was es ermöglichte
Übergangsraten als Funktion der Ionenstärke im Motilitätspuffer zu
bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die
zwei Motilitätsmoden von DK4mer zwei unabhängigen und
möglicherweise einander ausschließenden Interaktionsmoden mit dem
MT entsprechen. Diese unterschiedlichen MT-Interaktionsmoden
könnten auch für die Regulation von nativen kinesin-5
Motorproteinen relevant sein
Deletion of the tail domain of the kinesin-5 Cin8 affects its directionality
Background: Single molecules of the kinesin-5 Cin8 were previously demonstrated to be minus-end-directed under highionic- strength conditions. Results: Under high-ionic-strength conditions, Cin8 lacking the tail domain is bidirectional. Conclusion: The tail domain is one of the factors that regulate Cin8 directionality. Significance: An important structural element was identified that regulates the directionality of kinesin-5 motors
Sparen, wenn das Geld gerade so zum Leben reicht: Das Risiko des Abbruchs privater Altersvorsorge unter den Rahmenbedingungen von Riester-Förderung und Sozialgesetzbuch II
In Germany, supplementary old-age provision has become important for persons covered by the statutory pension insurance scheme. To promote private provision especially of low-earners the state provides financial support within the framework of the ’Riester pension". Furthermore, the Social Code II ensures that the majority of persons claiming basic income support for needy jobseekers do not have to use their private old-age savings for maintaining a livelihood. This study analyses to what extent these measures have helped stabilise the saving processes in low income groups. Based on the third wave of the household survey PASS we find that the protection rules in the Social Code II have so far played a rather minor role. Decreasing incomes, however, turn out to be of great importance for cancelling old-age pension contributions. Moreover, there is circumstantial evidence that the Riester subsidy particularly enables persons with low income to continue saving for retirement