Analysis of Infection Relevant Protein Domains of the Adeno-Associated Virus Serotype 8 in Comparison to Serotype 2

Ausgangspunkt für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen war die außergewöhnlich hohe Gentransduktionseffizienz von AAV8 Vektoren. Ein Vergleich zwischen AAV2 und AAV8 konnte zeigen, dass sich grundlegende Unterschiede auf den Kapsid Oberflächen befinden, trotz einer 83 % Homologie auf der Proteinsequenzebene zwischen beiden Serotypen. Ziel dieser Studie war es, die Rolle verschiedener Kapsidabschnitte beim Gentransfer zu charakterisieren. In Mutanten waren entweder große Sequenzabschnitte zwischen AAV2 und AAV8 oder einzelne Aminosäuren von AAV2 nach AAV8 oder von AAV8 nach AAV2 ausgetauscht worden. Das Ersetzen von großen AAV2 Kapsiddomänen im AAV8 Kapsid zeigte, dass insbesondere ein Sequenzabschnitt, der in die Bildung der Kapsidoberfläche involviert ist, einen großen Einfluss auf die Gentransduktion von AAV8 hatte. Der Austausch von einzelnen Aminosäuren in dieser Region des Kapsids verursachte für AAV8, sowie auch für AAV2 Partikel, einen starken Einfluss auf die Genexpression in vivo. Im Vergleich zum Wildtyp AAV8 Kapsid konnten Kapsidoberflächenmutanten eine Transduktionssteigerung, aber auch eine Transduktionssenkung induzieren. Eine Substitution, die sich im Inneren des Kapsidmantels befand, verursachte einen vollständigen Verlust der Gentransduktion mittels AAV8 Vektoren. Hingegen konnte eine weitere Substitution, die an der inneren Schulter der "Kapsid-Spikes" generiert worden war und Heparinbindung für das AAV8 Kapsid erzeugt hatte, die Transduktionseffizienz von AAV8 noch steigern. Überraschenderweise konnte eine reverse Substitution von AAV2 Aminosäuren durch Aminosäuren von AAV8 im Bereich der inneren Schulter der "Spikes" ebenfalls zu einer Steigerung der Gentransduktion von AAV2 -teilweise sogar auf das Niveau von AAV8 - bewirken. Nach der Analyse von Domänen, die die Gentransduktion von AAV8 beeinflussen, wurde in das AAV8 Kapsid eine Insertionsstelle eingefügt, um zu testen, ob das Kapsid aufgrund von insertierten Peptidsequenzen sein "Targetingprofil" verändert. Bekannte Peptidsequenzen, die in AAV2 Vektoren ein "Retargeting" bewirkt hatten, konnten auch im AAV8 Kapsid ein verändertes "Targeting" verursachen. Eine AAV8 Bibliothek mit zufälligen Peptidsequenzen in dieser Insertionsstelle wurde für die Selektion von Leber-spezifischen Vektoren verwendet. Es wurden Peptidmotive isoliert, die den unerwünschten Gentransfer von AAV8 Vektoren auf andere Organe als Lebergewebe drastisch reduzierten. Studien mit einem monoklonalen Antikörper gegen AAV8 Kapside zeigten, dass dieser an dieselbe Stelle im AAV8 Kapsid bindet, in welche die Peptide insertiert wurden und welche nach Austausch gegen AAV2 Aminosäuren zu einer Transduktionssteigerung führte. Die Bindung der Antikörper an das Kapsid neutralisierte die Infektion, verhinderte aber nicht die Virusaufnahme in die Zelle. Der Mechanismus der Neutralisierung konnte jedoch nicht vollständig aufgeklärt werden

Peptide Ligands Incorporated into the Threefold Spike Capsid Domain to Re-Direct Gene Transduction of AAV8 and AAV9 In Vivo

Efficiency and specificity of viral vectors are vital issues in gene therapy. Insertion of peptide ligands into the adeno-associated viral (AAV) capsid at receptor binding sites can re-target AAV2-derived vectors to alternative cell types. Also, the use of serotypes AAV8 and -9 is more efficient than AAV2 for gene transfer to certain tissues in vivo. Consequently, re-targeting of these serotypes by ligand insertion could be a promising approach but has not been explored so far. Here, we generated AAV8 and -9 vectors displaying peptides in the threefold spike capsid domain. These peptides had been selected from peptide libraries displayed on capsids of AAV serotype 2 to optimize systemic gene delivery to murine lung tissue and to breast cancer tissue in PymT transgenic mice (PymT). Such peptide insertions at position 590 of the AAV8 capsid and position 589 of the AAV9 capsid changed the transduction properties of both serotypes. However, both peptides inserted in AAV8 did not result in the same changes of tissue tropism as they did in AAV2. While the AAV2 peptides selected on murine lung tissue did not alter tropism of serotypes 8 and -9, insertion of the AAV2-derived peptide selected on breast cancer tissue augmented tumor gene delivery in both serotypes. Further, this peptide mediated a strong but unspecific in vivo gene transfer for AAV8 and abrogated transduction of various control tissues for AAV9. Our findings indicate that peptide insertion into defined sites of AAV8 and -9 capsids can change and improve their efficiency and specificity compared to their wild type variants and to AAV2, making these insertion sites attractive for the generation of novel targeted vectors in these serotypes

Der Kinder Gottes Seelige Heim-fahrt ins Ewige Leben : bei Christlicher Leich-Bestattung Der ... Frauen Annen Christinen Des ... Herrn Balthasar Rauppen ... Pfarr-Substituti zu Gerstungen Ehe-Liebsten/ Welche den 7. Maij dieses 1673sten Jahrs ... verstorben/ und den 9. eiusdem ... in der Kirchen daselbsten ... beygesezzet worden Nach Anleitung eines Prophetischen Spruchs erkläret / Von M. Joh. Christoph Zerbsten Diacono der Kirchen zu Eisennach

DER KINDER GOTTES SEELIGE HEIM-FAHRT INS EWIGE LEBEN : BEI CHRISTLICHER LEICH-BESTATTUNG DER ... FRAUEN ANNEN CHRISTINEN DES ... HERRN BALTHASAR RAUPPEN ... PFARR-SUBSTITUTI ZU GERSTUNGEN EHE-LIEBSTEN/ WELCHE DEN 7. MAIJ DIESES 1673STEN JAHRS ... VERSTORBEN/ UND DEN 9. EIUSDEM ... IN DER KIRCHEN DASELBSTEN ... BEYGESEZZET WORDEN NACH ANLEITUNG EINES PROPHETISCHEN SPRUCHS ERKLÄRET / VON M. JOH. CHRISTOPH ZERBSTEN DIACONO DER KIRCHEN ZU EISENNACH Der Kinder Gottes Seelige Heim-fahrt ins Ewige Leben : bei Christlicher Leich-Bestattung Der ... Frauen Annen Christinen Des ... Herrn Balthasar Rauppen ... Pfarr-Substituti zu Gerstungen Ehe-Liebsten/ Welche den 7. Maij dieses 1673sten Jahrs ... verstorben/ und den 9. eiusdem ... in der Kirchen daselbsten ... beygesezzet worden Nach Anleitung eines Prophetischen Spruchs erkläret / Von M. Joh. Christoph Zerbsten Diacono der Kirchen zu Eisennach (1) Titelseite (1) Widmung (2) Leichpredigt (5) Personalia (44) Cypressen-Zweig (53

Mapping a neutralizing epitope onto the capsid of adeno-associated virus serotype 8.

Adeno-associated viruses (AAVs) are small single-stranded DNA viruses that can package and deliver nongenomic DNA for therapeutic gene delivery. AAV8, a liver-tropic vector, has shown great promise for the treatment of hemophilia A and B. However, as with other AAV vectors, host anti-capsid immune responses are a deterrent to therapeutic success. To characterize the antigenic structure of this vector, cryo-electron microscopy and image reconstruction (cryo-reconstruction) combined with molecular genetics, biochemistry, and in vivo approaches were used to define an antigenic epitope on the AAV8 capsid surface for a neutralizing monoclonal antibody, ADK8. Docking of the crystal structures of AAV8 and a generic Fab into the cryo-reconstruction for the AAV8-ADK8 complex identified a footprint on the prominent protrusions that flank the 3-fold axes of the icosahedrally symmetric capsid. Mutagenesis and cell-binding studies, along with in vitro and in vivo transduction assays, showed that the major ADK8 epitope is formed by an AAV variable region, VRVIII (amino acids 586 to 591 [AAV8 VP1 numbering]), which lies on the surface of the protrusions facing the 3-fold axis. This region plays a role in AAV2 and AAV8 cellular transduction. Coincidently, cell binding and trafficking assays indicate that ADK8 affects a postentry step required for successful virus trafficking to the nucleus, suggesting a probable mechanism of neutralization. This structure-directed strategy for characterizing the antigenic regions of AAVs can thus generate useful information to help re-engineer vectors that escape host neutralization and are hence more efficacious

Biodistribution analysis of tropism-modified vectors.

<p>Vector genome copy numbers in various tissues were quantified by quantitative real-time PCR using CMV-promoter-specific primers. Tissues were harvested 28 days after intravenous injection of capsid-modified or wild type vectors, respectively. Recovered vector genome numbers are shown for <b>A</b> liver, <b>B</b> cardiac, and <b>C</b> lung tissue. (n = 3 animals per group).</p

Design of novel peptide insertion sites in capsid regions adjacent to the threefold-spike in serotypes AAV8 and AAV9.

<p><b>A:</b> Sequence alignment of surface exposed capsid domains encoded by the <i>cap</i> gene of the AAV serotypes 2, 8, and 9. Parts of the heparin binding domain 484-RQQR-487 and the integrin binding motif 511-NGR-513 are strongly conserved among the three serotypes. While AAV8 and -9 both contain an R at position 532, marked differences in the sequences are apparent at positions 585–588. Domains highlighted in B are tagged by colored rectangles. Alignment of the serotype sequences was carried out using BioEdit Sequence Alignment Editor Software. <b>B:</b> Capsid domains of AAV2 known to be involved in receptor binding are highlighted in blue (R484; R487), yellow (511-NGR-513), green (K532), and red (R585; R588). Surface rendering and mapping of the threefold-spike region was performed using PyMOL with the crystal structure of AAV2 supplied as template (PDB ID: 1lp3 <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0023101#pone.0023101-Xie1" target="_blank">[50]</a>). <b>C:</b> Design of AAV8 and -9 constructs for the incorporation of oligonucleotides encoding targeting peptides into the <i>cap</i> gene. The amino acid sequence of the <i>cap</i> gene for each corresponding serotype (single letter amino acid code) is depicted in black letters; differences compared to the respective wild type sequence are shown in blue letters. Red indicates seven additional amino acid residues from the insertion of oligonucleotides encoding a known peptide ligand for the re-direction of AAV serotypes. <b>D:</b> Model of the VP-3 capsid protein of AAV2 and localization of R588 and <b>E:</b> model of the VP-3 protein of AAV8 capsid and localization of R590. The potential peptide insertion site is depicted in yellow. Basic amino acids are depicted in red, acidic amino acids in blue. The VP-3 model of AAV2 and AAV8 was generated using Cn3D with coordinates PDB ID: 1lp3 for AAV2 <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0023101#pone.0023101-Xie1" target="_blank">[50]</a> and PDB ID: 2QA0 for AAV8 <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0023101#pone.0023101-Nam1" target="_blank">[37]</a> serving as template.</p