Upgrading a pyrolytic side stream by utilization as substrate for fungal L-malic acid production

Der Klimawandel, das zunehmende Bevölkerungswachstum sowie die damit verbundene Verknappung von Ressourcen zählen zu den zentralen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts und erfordern langfristig eine Umstrukturierung der auf fossilen Energieträgern basierenden Wirtschaft hin zu einem verstärkten Einsatz nachwachsender Rohstoffe in ressourcenschonenden, kreislauffähigen Prozessen. Lignocellulosehaltige Restströme aus der Land- und Forstwirtschaft eignen sich in besonderem Maße als solche Rohstoffe, da sie dank ihrer hohen Verfügbarkeit kostengünstig sind und zudem den Vorteil bieten, nicht in Konkurrenz zur Lebensmittelindustrie zu stehen. Das wässrige Kondensat, das bei der pyrolytischen Umwandlung von Weizenstroh zu flüssigen Biokraftstoffen entsteht, fällt aufgrund seines hohen Wassergehalts und niedrigen Heizwertes derzeit als ein solcher lignocellulosebasierter Reststrom an. Es enthält jedoch diverse organische Kohlenstoffverbindungen, die es für eine stoffliche Verwertung als Substrat in mikrobiellen Fermentationen interessant machen. Als besonders vielversprechend ist dabei der Einsatz für eine biotechnologische L-Äpfelsäureproduktion mit dem Schimmelpilz Aspergillus oryzae anzusehen, da der natürliche Säureproduzent in der Lage ist, mit Acetat einen der Hauptbestandteile des Pyrolysekondensats zu verstoffwechseln. Da Äpfelsäure aktuell weitestgehend über chemische Synthese aus fossilen Rohstoffen gewonnen wird, könnte mit diesem Vorhaben gleichzeitig das Anfallen eines ungenutzten Reststromes vermieden und ein bio-basierter Säureproduktionsprozess etabliert werden, der aufgrund der geringen Substratkosten wirtschaftlich konkurrenzfähiger zu herkömmlichen Herstellungsverfahren ist. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand daher in der Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung dieser vor allem für die Lebensmittelindustrie bedeutsamen organischen Säure auf Basis des Pyrolysekondensats. Da das sogenannte Schwelwasser neben verwertbaren Kohlenstoffen jedoch auch eine Vielzahl an Komponenten enthält, die das mikrobielle Wachstum erschweren, wurden in der aktuellen Arbeit auch potentielle Ansätze zur Erhöhung der pilzlichen Toleranz gegenüber dem Pyrolysekondensat untersucht. Mittels Transkriptom-Analyse sollten dafür im 3. Kapitel dieser Dissertation Gene identifiziert werden, die bei der Verwendung von Schwelwasser als Substrat in Schüttelkolbenkulturen eine stark veränderte Expression im Vergleich zu Glucose und Acetat aufweisen. Solche Gene könnten in Zukunft als Ansatzpunkte für Manipulationen des Genoms von A. oryzae interessant sein, die auf die Verbesserung der Schwelwasserverwertbarkeit abzielen. Da Acetat ein Hauptbestandteil des Schwelwassers ist, zeigten sich für beide Substrate verglichen mit Glukose teilweise ähnliche Änderungen in der Genexpression. Als zentrale transkriptionelle Reaktion auf das Wachstum in den acetathaltigen Kulturen wurde dabei die Hochregulierung von Genen beobachtet, die mit dem Glutathion-System sowie der Biosynthese der Aminosäuren Arginin, Serin, Cystein und Tryptophan assoziiert sind. Solche Expressionsänderungen wurden bereits als typische Reaktion auf externe Stressoren beschrieben und zeigen demnach, dass selbst der Einsatz von Acetat als alleiniges Substrat eine pilzliche Stressantwort induziert. Über den direkten Vergleich der Genexpression bei Wachstum auf Acetat und Schwelwasser konnte zudem ein Einblick in die transkriptionelle Antwort von A. oryzae auf die im Pyrolysekondensat vorhandenen Inhibitoren gewonnen werden. Der Pyruvat-Metabolismus erwies sich dabei als der einzige Stoffwechselweg mit einer signifikant unterschiedlichen Expression und umfasste in erster Linie Gene, die für verschiedene Alkoholdehydrogenasen sowie für am Abbau von Methylglyoxal beteiligte Enzyme kodieren. Zudem hatte sich bei Wachstum auf Schwelwasser eine stark erhöhte Expression eines sogenannten „old yellow enzymes“ ergeben. All diese Enzyme sind von großem Interesse für die Erhöhung der pilzlichen Schwelwassertoleranz mittels genetischer Modifikation, da sie mit dem Abbau der teils toxisch wirkenden Schwelwasserkomponenten Furfural, Acetol und 2-Cyclopenten-1-on in Verbindung stehen. Aber auch eine gezielte Variation des Expressionslevels von Genen des Glutathion-Systems und der Aminosäuresynthese können sich positiv auf die allgemeine Stressresistenz des Pilzes auswirken und zukünftig das Wachstum auf Schwelwasser erleichtern. Da der A. oryzae DSM1863 Wildtypstamm ohne eine vorherige Entfernung inhibierender Komponenten nicht in der Lage ist, das Schwelwasser als Substrat zu nutzen, musste bereits im Vorfeld der Transkriptom-Analyse eine Detoxifizierung des Pyrolysekondensats mittels Overliming, Rotationsverdampfen und anschließender Aktivkohlebehandlung erfolgen. Die dadurch erzielte Steigerung der pilzlichen Schwelwassertoleranz war jedoch nicht ausreichend, um eine Malatproduktion zu gewährleisten, so dass im Kapitel 4 dieser Arbeit eine weitere Optimierung der Vorbehandlungsprozedur angestrebt wurde. Neben den bereits genannten Methoden zur Detoxifizierung des Schwelwassers wurde auch eine enzymatische Behandlung mit Laccase aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor durchgeführt, die sich vor allem gegen phenolische Komponenten des Kondensats richtet. Für jede einzelne Vorbehandlungsmethode wurden diverse Reaktionsbedingungen untersucht und die Detoxifizierungseffizienz anhand von Wachstumstests und der Analyse ausgewählter Schwelwasserkomponenten beurteilt. Dabei zeigte sich für die Laccasebehandlung trotz der Entfernung phenolischer Substanzen mit einem Wachstum auf maximal 1,25 % Schwelwasser keine nennenswerte Verbesserung der pilzlichen Toleranz im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Im Gegensatz dazu ermöglichten die Behandlungen mit Aktivkohle, Overliming und Rotationsverdampfung unter optimierten Bedingungen ein pilzliches Wachstum auf Schwelwasserkonzentrationen von bis zu 1,625 %, 12,5 % bzw. 30 %. Als optimal wurde dabei für die Aktivkohlebehandlung eine Kohlenstoffkonzentration von 10 % und eine Behandlungsdauer von 10 min ermittelt, während die Overlimingbehandlung idealerweise bei einem mit NaOH eingestellten initialen pH-Wert von 12 und 100 °C durchgeführt werden sollte. Die besten Detoxifizierungsergebnisse wurden mit der 4-stündigen Rotationsverdampfung bei 200 mbar erzielt, da eine vollständige Entfernung von Guajakol und eine starke Verringerung der Konzentrationen von Acetol, Furfural, 2-Cyclopenten-1-on und Phenol um 84,9 %, 95,4 %, 97,7 % bzw. 86,2 % beobachtet wurden. Nach der Identifizierung der optimalen Reaktionsbedingungen wurden Kombinationen der einzelnen Detoxifizierungsmethoden durchgeführt und festgestellt, dass eine sequentielle Behandlung des Pyrolysekondensats mittels Rotationsverdampfung, Overliming und Aktivkohle die Nutzung von 100 % Schwelwasser als alleiniges Substrat für das Wachstum von A. oryzae ermöglicht. In Kapitel 5 dieser Dissertation wurde schließlich evaluiert, inwieweit sich das Kondensat aus der Schnellpyrolyse nach einer Behandlung mit dem optimierten Detoxifizierungsverfahren auch für die pilzliche L-Äpfelsäureproduktion eignet. Nachdem die Transkriptom-Analyse bereits erste Hinweise darauf ergeben hatte, sollte jedoch zuvor geprüft werden, ob mit Acetol auch der zweite Hauptbestandteil des Schwelwassers von A. oryzae als Substrat verwertet werden kann. Es wurden daher verschiedene Konzentrationen des Ketons als alleinige C-Quelle sowie in einfachen Schwelwassermodellmischungen mit 40 g/L Acetat auf ihre Eignung für die pilzliche Biomassebildung und Malatproduktion untersucht. Dabei zeigte sich, dass Acetolgehalte von bis zu 40 g/L für das Wachstum von A. oryzae eingesetzt werden können, wobei jedoch mit steigender Konzentration eine zunehmende Inhibierung festgestellt wurde. Eine Äpfelsäureproduktion alleine auf Basis des Ketons schien hingegen nicht möglich. Auch in den Kultivierungen mit Modellschwelwässern war eine zunehmende inhibierende Wirkung des Ketons zu beobachten, so dass für Konzentrationen über 20 g/L Acetol weder Wachstum noch eine Malatproduktion verzeichnet werden konnten. Demnach erscheint eine Entfernung des Ketons aus dem Schwelwasser über entsprechende Vorbehandlungen in der Tat notwendig, um eine effektive Säureproduktion zu gewährleisten. Mithilfe der optimierten Detoxifizierungsprozedur aus dem vorherigen Kapitel konnte die Acetolkonzentration im Schwelwasser auf ca. 3 g/L herabgesetzt und so in einer ersten Schüttelkolbenkultivierung ein maximaler Malattiter von 3,37 ± 0,61 g/L erzielt werden. Der hohe pH-Wert der Kulturen wurde dabei als ein kritischer Faktor identifiziert, der die Produktion noch höherer Äpfelsäurekonzentrationen verhinderte. Es erfolgte daher nachfolgend eine Optimierung des Anfangs-pH-Wertes unter Verwendung von 96 % Schwefelsäure und 100 % Essigsäure, die eine Steigerung der Malatproduktion auf 8,29 ± 0,26 g/L bzw. 9,77 ± 0,55 g/L ermöglichte. Abschließend wurde ein Scale-up des optimierten Prozesses in 500 mL Bioreaktoren vorgenommen und dabei mit einer Gesamtproduktivität von 0,051 ± 0,002 g/(L∙h) der bisher höchste Wert unter allen in dieser Arbeit durchgeführten Schwelwasserkultivierungen erzielt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Verwendung des Pyrolysekondensats als Substrat für die Malatproduktion mit A. oryzae durch die Wahl geeigneter Detoxifizierungsmethoden grundsätzlich realisierbar ist. Um jedoch eine möglichst ganzheitliche Verwertung des Schwelwassers zu gewährleisten und die Kosten und den Aufwand für Vorbehandlungen so gering wie möglich zu halten, sollte auch der Ansatz einer genetischen Modifikation des Pilzes zukünftig weiterverfolgt werden. Mit dieser Arbeit wurde eine gute Grundlage für solche Ansätze geschaffen, da Gene identifiziert wurden, die an der Reaktion des Pilzes auf das Vorhandensein von Schwelwasser und den darin enthaltenen Inhibitoren beteiligt sind

Valorization of a Pyrolytic Aqueous Condensate and Its Main Components for L-Malic Acid Production with Aspergillus oryzae DSM 1863

Pyrolytic aqueous condensate (PAC) might serve as a cost-effective substrate for microbial malic acid production, as it is an unused side stream of the fast pyrolysis of lignocellulosic biomass that contains acetol and acetate as potential carbon sources. In the present study, shake flask cultures were performed to evaluate the suitability of acetol and its combination with acetate as substrates for growth and L-malate production with the filamentous fungus Aspergillus oryzae. Acetol concentrations of up to 40 g/L were shown to be utilized for fungal growth. In combination with acetate, co-metabolization of both substrates for biomass and malate formation was observed, although the maximum tolerated acetol concentration decreased to 20 g/L. Furthermore, malate production on PAC detoxified by a combination of rotary evaporation, overliming and activated carbon treatment was studied. In shake flasks, cultivation using 100% PAC resulted in the production of 3.37 ± 0.61 g/L malate, which was considerably improved by pH adjustment up to 9.77 ± 0.55 g/L. A successful scale-up to 0.5-L bioreactors was conducted, achieving comparable yields and productivities to the shake flask cultures. Accordingly, fungal malate production using PAC was successfully demonstrated, paving the way for a bio-based production of the acid

Detoxification of a pyrolytic aqueous condensate from wheat straw for utilization as substrate in Aspergillus oryzae DSM 1863 cultivations

Background: The pyrolytic aqueous condensate (PAC) formed during the fast pyrolysis of wheat straw contains a variety of organic carbons and might therefore potentially serve as an inexpensive substrate for microbial growth. One of its main components is acetic acid, which was recently shown to be a suitable carbon source for the filamentous fungus Aspergillus oryzae. However, the condensate also contains numerous toxic compounds that inhibit fungal growth and result in a tolerance of only about 1%. Therefore, to enable the use of the PAC as sole substrate for A. oryzae cultivations, a pretreatment seems to be necessary. Results Various conditions for treatments with activated carbon, overliming, rotary evaporation and laccase were evaluated regarding fungal growth and the content of inhibitory model substances. Whereas the first three methods considerably increased the fungal tolerance to up to 1.625%, 12.5% and 30%, respectively, the enzymatic treatment did not result in any improvement. The optimum carbon load for the treatment with activated carbon was identified to be 10% (w/v) and overliming should ideally be performed at 100 °C and an initial pH of 12. The best detoxification results were achieved with rotary evaporation at 200 mbar as a complete removal of guaiacol and a strong reduction in the concentration of acetol, furfural, 2-cyclopenten-1-one and phenol by 84.9%, 95.4%, 97.7% and 86.2%, respectively, were observed. Subsequently, all possible combinations of the effective single methods were performed and rotary evaporation followed by overliming and activated carbon treatment proved to be most efficient as it enabled growth in 100% PAC shake-flask cultures and resulted in a maximum cell dry weight of 5.21 ± 0.46 g/L. Conclusion This study provides a comprehensive insight into the detoxification efficiency of a variety of treatment methods at multiple conditions. It was revealed that with a suitable combination of these methods, PAC toxicity can be reduced to such an extent that growth on pure condensate is possible. This can be considered as a first important step towards a microbial valorization of the pyrolytic side-stream with A. oryzae

RNA-Seq Based Transcriptome Analysis of Aspergillus oryzae DSM 1863 Grown on Glucose, Acetate and an Aqueous Condensate from the Fast Pyrolysis of Wheat Straw

Due to its acetate content, the pyrolytic aqueous condensate (PAC) formed during the fast pyrolysis of wheat straw could provide an inexpensive substrate for microbial fermentation. However, PAC also contains several inhibitors that make its detoxification inevitable. In our study, we examined the transcriptional response of Aspergillus oryzae to cultivation on 20% detoxified PAC, pure acetate and glucose using RNA-seq analysis. Functional enrichment analysis of 3463 significantly differentially expressed (log2FC >2 & FDR < 0.05) genes revealed similar metabolic tendencies for both acetate and PAC, as upregulated genes in these cultures were mainly associated with ribosomes and RNA processing, whereas transmembrane transport was downregulated. Unsurprisingly, metabolic pathway analysis revealed that glycolysis/gluconeogenesis and starch and sucrose metabolism were upregulated for glucose, whereas glyoxylate and the tricarboxylic acid (TCA) cycle were important carbon utilization pathways for acetate and PAC, respectively. Moreover, genes involved in the biosynthesis of various amino acids such as arginine, serine, cysteine and tryptophan showed higher expression in the acetate-containing cultures. Direct comparison of the transcriptome profiles of acetate and PAC revealed that pyruvate metabolism was the only significantly different metabolic pathway and was overexpressed in the PAC cultures. Upregulated genes included those for methylglyoxal degradation and alcohol dehydrogenases, which thus represent potential targets for the further improvement of fungal PAC tolerance

HisB as novel selection marker for gene targeting approaches in Aspergillus niger

Background For Aspergillus niger, a broad set of auxotrophic and dominant resistance markers is available. However, only few offer targeted modification of a gene of interest into or at a genomic locus of choice, which hampers functional genomics studies. We thus aimed to extend the available set by generating a histidine auxotrophic strain with a characterized hisB locus for targeted gene integration and deletion in A. niger. Results A histidine-auxotrophic strain was established via disruption of the A. niger hisB gene by using the counterselectable pyrG marker. After curing, a hisB - , pyrG - strain was obtained, which served as recipient strain for further studies. We show here that both hisB orthologs from A. nidulans and A. niger can be used to reestablish histidine prototrophy in this recipient strain. Whereas the hisB gene from A. nidulans was suitable for efficient gene targeting at different loci in A. niger, the hisB gene from A. niger allowed efficient integration of a Tet-on driven luciferase reporter construct at the endogenous non-functional hisB locus. Subsequent analysis of the luciferase activity revealed that the hisB locus is tight under non-inducing conditions and allows even higher luciferase expression levels compared to the pyrG integration locus. Conclusion Taken together, we provide here an alternative selection marker for A. niger, hisB, which allows efficient homologous integration rates as well as high expression levels which compare favorably to the well-established pyrG selection marker.EC/FP7/303864/EU/Bridging the world of fungi and dementia/PROFITSTU Berlin, Open-Access-Mittel - 201

Co-Fermenting Pyrolysis Aqueous Condensate and Pyrolysis Syngas with Anaerobic Microbial Communities Enables L-Malate Production in a Secondary Fermentative Stage

The pyrolytic conversion of lignocellulosic biomass into fuels and chemicals is a promising option for the valorization of agricultural and forestry residues. However, technological developments are still needed to maximize product recovery and carbon fixation of the pyrolysis process. The pyrolysis aqueous condensate (PAC), a pyrolysis by-product, has a high water content and is highly toxic, hampering its use. The anaerobic digestion of PAC from different biomasses has been proven a viable technology for PAC valorization and detoxification, but its toxicity limits the methanogenic potential. Alternatively, methanation or VFA production from syngas by anaerobic mixed cultures are technologies of scientific interest. This study investigates the potential of a two-stage process to convert the carbon and energy in syngas and PAC into L-malate. PAC and syngas were co-fermented by two mixed cultures at 37 and 55 °C, identifying kinetic inhibitions and the effects of increasing PAC concentrations on the product pool. The media from selected mixed culture fermentations were then inoculated with Aspergillus oryzae for L-malate production. The results show that mixed cultures can perform simultaneous syngas fermentation and PAC detoxification. While PAC concentrations above 2% completely inhibited methanogenesis, CO consumption was inhibited at PAC concentrations above 5%, regardless of the temperature. In fermentations where PAC inhibited methanation, the mixed cultures channelled the carbon and electrons from syngas and PAC to volatile fatty acids or acetate/H2 production, depending on the incubation temperature. Substantial detoxification of PAC was observed under PAC concentrations up to 10% independently of the rates of syngas metabolism. PAC detoxification enabled the further valorization of the acetate produced via syngas and PAC fermentations into L-malate, achieving yields up to 0.17 mM/mM. These results are promising for the development of an integrated process that simultaneously detoxifies and recovers value from gaseous and aqueous waste streams originating from pyrolysis

Teaching on Chinese Writing in Binus University

Combination of practice teaching Chinese as a foreign language in BINUS University, this article takes the Chinese writing teaching as an example, and analyses “as the student core, as the fun concept” writing modes. Firstly, serious explain: increasing the vitality of classroom teaching, using multimedia methods to make students get interested in; Secondly, article practice: making the written expression be the basis and revealing true feelings as commander, constantly pursue the aesthetic article; Thirdly, feedback and communion: using Facebook, Binusmaya, Binusblog, Chinese newspapers and other channels of interaction to communicate between teachers and students. Through the three steps, we could select the theme which students loved, create a relaxed atmosphere in the writing class, and then the students will be pleasure of writing gradually

Hypotonic osmotic shock treatment to enhance lipid and protein recoveries from concentrated saltwater Nannochloropsis slurries

This study reports the use of hypotonic osmotic shock as a treatment step to enhance the recoveries of biofuel-convertible lipids and proteins from lipid-rich saltwater Nannochloropsis gaditana (N. gaditana) slurries (biomass content = ~140 mg biomass / g slurry, total lipid content = ~600 mg lipid /g biomass). The osmotic shock was induced through repeated washing of microalgal slurries with multiple batches of fresh water. Subjecting the slurries to 2 stages of freshwater washing resulted in a measurable damage to cell membranes (the uptake of membrane permeability marker increased by 6 folds), a partial loss of cell viability (only 64% of available cells were recoverable), and a minor release of free protein (~2 wt% of available protein) from the biomass into the interstitial space of the slurries. Hypotonic osmotic shock was revealed to be ineffective in rupturing N. gaditana slurries (only 13 ± 9% of available cells were ruptured after 2-stage washing) and, as such, had a limited prospect as a stand-alone cell disruption technology for the saltwater strain. The washing treatment, however, was found to be able to weaken the structural integrity of N. gaditana slurries and enhance the performance of subsequent mechanical or chemical cell disruption technologies when installed as a preparatory step. Applying the washing treatment prior to high-pressure homogenisation (HPH) and low-solvent-to-biomass ratio hexane extraction (hexane: slurry = 1:1 w/w) for the recovery of biofuel-convertible lipids increased the extent of cell rupture from 28 ± 8 to 46 ± 19% of available cells and more than doubled neutral lipid yield from 25.1 ± 2.0 to 64.6 ± 4.9 wt% of available neutral lipid. Initial analysis revealed that the washing treatment had a minimal energy cost (~6% of the total energy expenditure of downstream processing) and that its integration into HPH + hexane lipid recovery led to a 2.5 fold increase in the energy output of the biomass. Partnering the washing treatment with NaOH hydrolysis increased protein yield from 6.7 ± 2.4 to 31.9 ± 10.7 wt% of available protein

RNA-Seq Based Transcriptome Analysis of Aspergillus oryzae DSM 1863 Grown on Glucose, Acetate and an Aqueous Condensate from the Fast Pyrolysis of Wheat Straw

Due to its acetate content, the pyrolytic aqueous condensate (PAC) formed during the fast pyrolysis of wheat straw could provide an inexpensive substrate for microbial fermentation. However, PAC also contains several inhibitors that make its detoxification inevitable. In our study, we examined the transcriptional response of Aspergillus oryzae to cultivation on 20% detoxified PAC, pure acetate and glucose using RNA-seq analysis. Functional enrichment analysis of 3463 significantly differentially expressed (log2FC &gt;2 &amp; FDR &lt; 0.05) genes revealed similar metabolic tendencies for both acetate and PAC, as upregulated genes in these cultures were mainly associated with ribosomes and RNA processing, whereas transmembrane transport was downregulated. Unsurprisingly, metabolic pathway analysis revealed that glycolysis/gluconeogenesis and starch and sucrose metabolism were upregulated for glucose, whereas glyoxylate and the tricarboxylic acid (TCA) cycle were important carbon utilization pathways for acetate and PAC, respectively. Moreover, genes involved in the biosynthesis of various amino acids such as arginine, serine, cysteine and tryptophan showed higher expression in the acetate-containing cultures. Direct comparison of the transcriptome profiles of acetate and PAC revealed that pyruvate metabolism was the only significantly different metabolic pathway and was overexpressed in the PAC cultures. Upregulated genes included those for methylglyoxal degradation and alcohol dehydrogenases, which thus represent potential targets for the further improvement of fungal PAC tolerance