Gibberellin DELLA signaling targets the retromer complex to redirect protein trafficking to the plasma membrane

The plant hormone gibberellic acid (GA) is a crucial regulator of growth and development. The main paradigm of GA signaling puts forward transcriptional regulation via the degradation of DELLA transcriptional repressors. GA has also been shown to regulate tropic responses by modulation of the plasma membrane incidence of PIN auxin transporters by an unclear mechanism. Here we uncovered the cellular and molecular mechanisms by which GA redirects protein trafficking and thus regulates cell surface functionality. Photoconvertible reporters revealed that GA balances the protein traffic between the vacuole degradation route and recycling back to the cell surface. Low GA levels promote vacuolar delivery and degradation of multiple cargos, including PIN proteins, whereas high GA levels promote their recycling to the plasma membrane. This GA effect requires components of the retromer complex, such as Sorting Nexin 1 (SNX1) and its interacting, microtubule (MT)-associated protein, the Cytoplasmic Linker-Associated Protein (CLASP1). Accordingly, GA regulates the subcellular distribution of SNX1 and CLASP1, and the intact MT cytoskeleton is essential for the GA effect on trafficking. This GA cellular action occurs through DELLA proteins that regulate the MT and retromer presumably via their interaction partners Prefoldins (PFDs). Our study identified a branching of the GA signaling pathway at the level of DELLA proteins, which, in parallel to regulating transcription, also target by a nontranscriptional mechanism the retromer complex acting at the intersection of the degradation and recycling trafficking routes. By this mechanism, GA can redirect receptors and transporters to the cell surface, thus coregulating multiple processes, including PIN-dependent auxin fluxes during tropic responses

Gibberellin modulates root gravitropism via regulation of PIN stability

Auxin und Gibberellin zählen beide zu den klassischen Wachstumshormonen. Da sie ähnliche Wirkbereiche in der Pflanze abdecken, ist eine Vernetzung der beiden Hormone anzunehmen. In vorangegangenen Studien wurde ein direkter Einfluss von Auxin auf die GA-Biosynthese und GA-Perzeption nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit sollte komplementär die Wechselwirkung von GA auf auxinrelevante Prozesse untersucht werden. Der Gravitropismus ist ein ideales System, um dynamische, auxinabhängige Prozesse wie Auxinverteilung und PIN-Endomembranfluss in der Wurzel darzustellen. Um den GA-Gehalt oder die GA-Signaltransduktion in Pflanzen gezielt zu verändern wurden pharmakologische und genetische Manipulationen durchgeführt. Sowohl bei geringeren GA-Gehalten, wie sie nach Uniconazolbehandlung oder in der ga1-3 GA-Biosynthesemutante vorliegen, als auch bei erhöhten GA-Gehalten oder konstitutiv aktivierter GA-Signaltransduktion in der pentuple-Mutante war die gravitrope Krümmungsre aktion der Wurzel schwächer verglichen mit der des Wildtyps oder unbehandelter Kontrollen. In der pentuple-Mutante sind die DELLA-Gene RGA, GAI, RGL1, RGL2 und RGL3 durch T-DNA Insertionen defekt (Feng et al., 2008). Zur Visualisierung der asymmetrischen Auxinverteilung während der gravitropen Krümmungsreaktion wurde ein auxinsensitives Promotorkonstrukt (DR5::GFP) verwendet. Interessanterweise akkumulierte nach Gravistimulation bei gleichzeitiger GA-Behandlung Auxin symmetrisch, während bei geringeren GA-Gehalten (Uniconazolbehandlung) keine laterale Auxin Akkumulation erfolgte. Um Veränderungen der endogenen GA-Gehalte während des Gravitropismus zu zeigen, wurde ein GA-sensitiver Reporter (RGA::RGA-GFP) verwendet, der bei erhöhten GA-Gehalten abgebaut wird. Es konnte gezeigt werden, dass parallel zur asymmetrischen Auxinverteilung das RGA-GFP Signal auf der Unterseite gravistimulierter Wurzelspitzen signifikant schwächer wurde. Die asymmetrische GA-Verteilung während der gravitropen Krümmungsreaktion konnte durch eine asymmetrisch e GA-Detektion über den GA-spezifischen Antikörper in der Zellteilungs- und Elongationszone der Wurzelepidermis bestätigt werden. Des Weiteren wurden die Effekte von GA auf die PIN-Transkription und -Proteingehalte untersucht. Durch GA-Behandlung veränderte sich die PIN2 Expression nicht, jedoch zeigten sich veränderte PIN-Proteingehalte nach GA- oder Uniconazolgabe. Damit übereinstimmend zeigte sich gegenüber Kontrollpflanzen ein verzögerter Abbau des dexamethasoninduzierten PIN2-GFP Signals in GA-behandelten Pflanzen. Dieser Stabilisierungseffekt von GA scheint spezifisch für PIN-Proteine zu sein, da andere plasmamembranassoziierte Auxintransporter (AUX1 und PGP19) und ein Aquaporin (PIP2) nicht durch veränderte GA-Gehalte beeinflusst wurden. Der PIN-Proteingehalt der Plasmamembran wird durch eine Balance zwischen Degradation in der lytischen Vakuole und konstitutivem Recycling zurück zur Plasmamembran reguliert (Kleine-Vehn et al., 2008a). Eine Erhöhung der PIN-Proteinmenge an der Plasmamembran kann bei nicht-transkriptioneller Kontrolle durch Erniedrigung der Endozytose, Erhöhung der Exozytose oder verändertes Recycling erhöht werden. Da die Internalisierung von FM4-64, eines Endozytose-Indikators, durch veränderte GA-Gehalte nicht beeinflusst war, aber mehr PIN2 in BFA induzierten Endosomen akkumulierte, liegt der Schluss nahe, dass bei verstärkter GA-Bildung das PIN-Recycling vom PVC zurück zu den Endosomen gesteigert war. Um zu testen, ob der Retromer-abhängige Weg für den GA-induzierten Anstieg der PIN-Proteine an der Plasmamembran notwendig ist, wurden die Versuche im Hintergrund einer snx1-Mutante wiederholt, in der das Retromer-abhängige Recycling unterbrochen ist. In dieser Mutante zeigten sich keine GA-induzierten Effekte auf die PIN2-Proteingehalte. Die Gesamtheit der Daten lässt die Hypothese zu, dass nach Gravistimulation GA auf der Unterseite der Wurzel akkumuliert, wo es die PIN-Stabilität über den Retromer-abhängigen Weg beeinflusst und so die Balance zwischen Abbau und Recycling von PIN-Proteinen mitbestimmt

Clathrin Mediates Endocytosis and Polar Distribution of PIN Auxin Transporters in Arabidopsis[W]

This work demonstrates that clathrin-dependent endocytosis exists in plants. Moreover, it shows that clathrin function is required for polarity of PIN auxin transporters, auxin distribution, and associated developmental processes

Asymmetric gibberellin signaling regulates vacuolar trafficking of PIN auxin transporters during root gravitropism

Gravitropic bending of plant organs is mediated by an asymmetric signaling of the plant hormone auxin between the upper and lower side of the respective organ. Here, we show that also another plant hormone, gibberellie acid (GA), shows asymmetric action during gravitropic responses. lmmunodetection using an antibody against GA and monitoring GA signaling output by downstream degradation of DELLA proteins revealed an asymmetric GA distribution and response with the maximum at the lower side of gravistimulated roots. Genetic or pharmacological manipulation of GA levels or response affects gravity-mediated auxin redistribution and root bending response. The higher GA levels at the lower side of the root correlate with increased amounts of PIN-FORMED2 (PIN2) auxin transporter at the plasma membrane. The observed increase in PIN2 stability is caused by a specific GA effect on trafficking of PIN proteins to lytic vacuoles that presumably occurs downstream of brefeldin A-sensitive endosomes. Our results suggest that asymmetric auxin distribution instructive for gravity-induced differential growth is consolidated by the asymmetric action of GA that stabilizes the PIN-dependent auxin stream along the lower side of gravistimulated roots