Etablierung neuartiger fusogener Liposomen zur Lipidinterkalation in tierische Plasmamembranen : Analyse mittels zeitlich und räumlich hochauflösender lichtmikroskopischer Methoden

Sämtliche lebenden Zellen sind von Biomembranen umschlossen, höhere Zellen weisen auch einen sehr großen Anteil an inneren Membranen auf. Diese Membranen bestehen aus einer flüssigen Lipid-Doppelschicht mit sehr vielen eingebetteten Proteinen. Biomembranen erfüllen vielfältige biologische Funktionen, für deren Untersuchung die selektive Inkorporation künstlicher oder chemisch veränderter Membranmoleküle ein entscheidender Schritt ist. Die vorliegende Dissertation behandelt die Etablierung sowie Charakterisierung eines neuartigen Liposomen-Fusionssystems (die sogenannten fusogenen Liposomen) zur Interkalation fluoreszenzmarkierter Lipide in zelluläre Membranen. Dieses Interkalationssystem wurde eingesetzt, um biologisch aktive Phospholipide, Mikrodomänen-assoziierte Lipide sowie synthetische, amphipatische Moleküle effizient in Plasmamembranen einzuschleußen und deren Diffusion mittels zeitlich hochauflösender, lichtmikroskopischer Methoden zu analysieren. Dabei stand insbesondere die Analyse dieser Moleküle in proteinreichen, adhärierten Membranbereichen, den sogenannten Fokaladhäsionen, im Fokus. Fusogene Liposomen wurden 2009 am Institute of Complex Systems (ICS-7) entwickelt und wurden in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal für biologische Fragestellungen eingesetzt. Diese Liposomen fusionieren schnell und effizient mit Plasmamembranen. Sie bestehen aus neutralen und positiv geladenen Lipiden sowie Aromat-haltigen, amphipatischen Molekülen in einem bestimmten Mischungsverhältnis. Ein erweitertes Fusionssystem, bei dem ein synthetisches, amphipatisches und aromatisches Molekül (DiIC18(7)) die Fusion auslöst und dadurch die Interkalation biologisch relevanter Lipide über einen breiten Konzentrationsbereich ermöglicht, wurde erstmals in meiner Diplomarbeit vorgestellt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde dieses System verwendet, um fluoreszenzmarkierte Glycerophospholipide, Sphingolipide, Glycosphingolipide sowie Sterole in Plasmamembranen tierischer Zellen zu interkalieren und deren intrazelluläre Lokalisation, Transport- und Abbauwege zu betrachten. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten, biologisch aktiven Lipide effizient und schonend in die zelluläre Plasmamembranen eingebracht werden konnten. Von der Plasmamembran ausgehend reicherten sie sich entsprechend ihrer natürlichen, intrazellulären Lokalisation in unterschiedlichen Organellen an. Das Transportsystem beeinflusst demnach nicht die intrazelluläre Verteilung der untersuchten Lipide. Darüber hinaus zeigten sich Unterschiede in der Kinetik des membranständigen Signals. Das synthetische, amphipatische Molekül, welches die Fusion auslöst, wurde innerhalb weniger Stunden von der Plasmamembran ins Endomembransystem transportiert und dort innerhalb 24 Stunden lysosomal abgebaut. Phospholipide und Sterole mit freien Hydroxylgruppen hingegen sind bis zu 48 h in der Plasmamembran detektierbar. Zellvitalität sowie Proliferationsrate wurden nicht durch fusogene Liposomen verändert. Im nächsten Schritt wurde erstmals systematisch untersucht, welchen Einfluss die chemische Natur der beteiligten Moleküle auf die Effizienz des Transfers hat. Zur Quantifizierung der Effizienz wurde Durchflusszytometrie verwendet. Deren Ergebnisse wurden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überprüft. Die einzelnen Lipid-Komponenten, neutrales Lipid, positiv geladenes Lipid und Aromat-haltiges, amphipatisches Molekül wurden systematisch gegen Lipide mit unterschiedlichen Eigenschaften ausgetauscht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die positive Ladung als auch das delokalisierte π-Elektronensystem unabdingbar für die Membranfusion sind. Liposomen, welche nur aus positiv geladenen sowie fluoreszenzmarkierten Lipiden bestehen, fusionierten ebenfalls mit der Plasmamembran, allerdings bildeten sich hier kurz nach Fusion strukturelle Veränderung der Membran. Nur Liposomen, bei denen das neutrale Lipid eine Phosphoethanolamin-Kopfgruppe besitzt, waren zur Membranfusion fähig. Der Sättigungsgrad der Fettsäurekette hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die Fusogenität. Meine Experimente zeigten, dass bestimmte molekulare Gruppen in neutralen sowie den positiv geladenen Lipiden (Ethylgruppen am Glycerin-Rückgrat; Cholin-Kopfgruppen) eine für die Fusion wahrscheinlich wichtige Wechselwirkung zwischen positiver Ladung und Fluorophor verhindern, beziehungsweise negativ beeinflussen. In der Literatur wurde postuliert, dass invers-kubische (QII) und invers-hexagonale (HII) Phasen der beteiligten Membranen als Übergangszustände entscheidend für die Membranfusion seien. Diese Hypothese wird durch die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse voll und ganz unterstützt. Im dritten Versuchsteil wurde schließlich die Diffusion von fluoreszenzmarkierten Phospholipiden, Mikrodomänen-assoziierten Lipiden und synthetischen, amphipatischen Molekülen in zellulären Plasmamembranen und Modellmembranen mittels der Fluoreszenz-Korrelations-Spektoskopie (FCS) untersucht. Das Ziel dieser Arbeiten war es zu untersuchen, inwieweit die in Modellmembranen wohl etablierte flüssig-geordnete/flüssig-ungeordnete (LO/LD) Phasenseparation zur Erklärung der in Zellmembranen beschriebenen Mikrodomänen dienen kann. Die fusogenen Liposomen wurden so angepasst, dass fluoreszente Lipide in einem für FCS-Messungen optimalen Konzentrationsbereich eingebaut werden konnten. Es konnte bewiesen werden, dass die Mikrodomänen-assoziierten Lipide Sphingomyelin sowie Gangliosid GM1 in zellulären Fokaladhäsionen eine signifikant verlangsamte Diffusion im Vergleich zu nicht-adhärierten Membranbereichen besitzen. Cholesterol, Phosphatidylcholin sowie das synthetische, amphipatische Molekül zeigten keine Verlangsamung. Anhand der Versuche an phasenseparierten Riesenvesikeln konnte der Einfluss der höheren Membranordnung in Fokaladhäsionen, also die Anwesenheit einer flüssig-geordneten Domäne, als alleiniger Grund für die beobachtete, langsamere Diffusion von Sphingomyelin und GM1 widerlegt werden. Die Ergebnisse deuten insgesamt auf eine spezifische Protein-Lipid-Wechselwirkung sowie eine mögliche Anreicherung in kurzlebigen, sub-mikroskopischen Membrandomänen hin. Ingesamt gelang es in der vorliegenden Arbeit das 2009 entdeckte Membranfusions-System weiterzuentwickeln, Hinweise auf den zugrunde liegenden Mechanismus zu finden sowie es erstmals zur Untersuchung membran-physikochemischer Fragen einzusetzen

Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes

Cationic liposomes are frequently used as carrier particles for nucleic acid delivery. The most popular formulation is the equimolar mixture of two components, a cationic lipid and a neutral phosphoethanolamine. Its uptake pathway has been described as endocytosis. The presence of an aromatic molecule as a third component strongly influences the cellular uptake process and results in complete membrane fusion instead of endocytosis. Here, we systematically varied all three components of this lipid mixture and determined how efficiently the resulting particles fused with the plasma membrane of living mammalian cells. Our results show that an aromatic molecule and a cationic lipid component with conical molecular shape are essential for efficient fusion induction. While a neutral lipid is not mandatory, it can be used to control fusion efficiency and, in the most extreme case, to revert the uptake mechanism back to endocytosi

Fluorescence Correlation Spectroscopy Reveals Interaction of Some Microdomain-Associated Lipids with Cellular Focal Adhesion Sites

Cells adhere to the extracellular matrix at distinct anchoring points, mostly focal adhesions. These are rich in immobile transmembrane- and cytoskeletal-associated proteins, some of which are known to interact with lipids of the plasma membrane. To investigate their effect on lipid mobility and molecular interactions, fluorescently labeled lipids were incorporated into the plasma membranes of primary myofibroblasts using fusogenic liposomes. With fluorescence correlation spectroscopy, we tested mobilities of labeled microdomain-associated lipids such as sphingomyelin (SM), ganglioside (GM1), and cholesterol as well as of a microdomain-excluded phospholipid (PC) and a lipid-like molecule (DiIC18(7)) in focal adhesions (FAs) and in neighboring non-adherent membrane areas. We found significantly slower diffusion of SM and GM1 inside FAs but no effect on cholesterol, PC, and DiIC18(7). These data were compared to the molecular behavior in Lo/Ld-phase separated giant unilamellar vesicles, which served as a model system for microdomain containing lipid membranes. In contrast to the model system, lipid mobility changes in FAs were molecularly selective, and no particle enrichment occurred. Our findings suggest that lipid behavior in FAs cannot be described by Lo/Ld-phase separation. The observed slow-down of some molecules in FAs is potentially due to transient binding between lipids and some molecular constituent(s)