Comparison of homologous and heterologous prime-boost vaccine approaches using Modified Vaccinia Ankara and soluble protein to induce neutralizing antibodies by the human cytomegalovirus pentamer complex in mice

Since neutralizing antibodies (NAb) targeting the human cytomegalovirus (HCMV) pentamer complex (PC) potently block HCMV host cell entry, anti-PC NAb induction is thought to be important for a vaccine formulation to prevent HCMV infection. By developing a vaccine strategy based on soluble PC protein and using a previously generated Modified Vaccinia Ankara vector co-expressing all five PC subunits (MVA-PC), we compared HCMV NAb induction by homologous immunization using prime-boost vaccine regimen employing only PC protein or MVA-PC and heterologous immunization using prime-boost combinations of PC protein and MVA-PC. Utilizing a recently isolated anti-PC NAb, we produced highly pure soluble PC protein that displayed conformational and linear neutralizing epitopes, interfered with HCMV entry, and was recognized by antibodies induced by HCMV during natural infection. Mice vaccinated by different immunization routes with the purified PC protein in combination with a clinically approved adjuvant formulation elicited high-titer and durable HCMV NAb. While MVA-PC and soluble PC protein either alone or in combination elicited robust HCMV NAb, significantly different potencies of these vaccine approaches were observed in dependence on immunization schedule. Using only two immunizations, vaccination with MVA-PC alone or prime-boost combinations of MVA-PC and PC protein was significantly more effective in stimulating HCMV NAb than immunization with PC protein alone. In contrast, with three immunizations, NAb induced by soluble PC protein either alone or combined with two boosts of MVA-PC increased to levels that exceeded NAb titer stimulated by MVA-PC alone. These results provide insights into the potency of soluble protein and MVA to elicit NAb by the HCMV PC via homologous and heterologous prime-boost immunization, which may contribute to develop clinically deployable vaccine strategies to prevent HCMV infection

The AGMA1 poly(amidoamine) inhibits the infectivity of herpes simplex virus in cell lines, in human cervicovaginal histocultures, and in vaginally infected mice

The development of topical microbicides is a valid approach to protect the genital mucosa from sexually transmitted infections that cannot be contained with effective vaccination, like HSV and HIV infections. A suitable target of microbicides is the interaction between viral proteins and cell surface heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). AGMA1 is a prevailingly cationic agmatine-containing polyamidoamine polymer previously shown to inhibit HSPGs dependent viruses, including HSV-1, HSV-2, and HPV-16. The aim of this study was to elucidate the mechanism of action of AGMA1 against HSV infection and assess its antiviral efficacy and biocompatibility in preclinical models. The results show AGMA1 to be a non-toxic inhibitor of HSV infectivity in cell cultures and human cervicovaginal histocultures. Moreover, it significantly reduced the burden of infection of HSV-2 genital infection in mice. The investigation of the mechanism of action revealed that AGMA1 reduces cells susceptibility to virus infection by binding to cell surface HSPGs thereby preventing HSV attachment. This study indicates that AGMA1 is a promising candidate for the development of a topical microbicide to prevent sexually transmitted HSV infections

Sviluppo e validazione in vivo di un vaccino contro herpes genitale

L’herpes genitale è un’infezione che persiste per tutta la vita ed è causa della comparsa di lesioni genitali estremamente dolorose e ricorrenti, di complicazioni a livello sistemico, di morbidità psico-sociale e di complicazioni serie nei neonati da madri infette, che, anche se rare, possono portare ad handicap neurologici persistenti e a morte. Inoltre è stato dimostrato che l’herpes genitale incrementa il rischio di contrarre altre infezioni sessualmente trasmesse come ad esempio quella dovuta al virus dell’immunodeficienza umana (HIV). La principale causa di herpes genitale è il virus herpes simplex (HSV)-2, tuttavia una proporzione sempre crescente di episodi primari è dovuta ad HSV-1. La trasmissione di HSV per via genitale è solitamente dovuta alla liberazione del virus da parte di individui che non sono a conoscenza di essere infetti o ai quali i test clinici hanno fallito nel diagnosticare l’infezione. La prevalenza dell’herpes genitale aumenta non solo con l’età e con il numero di partner sessuali, ma anche in particolari gruppi etnici e socio-economici; tuttavia, l’infezione non è assolutamente limitata solo alla popolazione ad elevato rischio. Gli agenti antivirali, come ad esempio l’aciclovir, possono ridurre la severità della malattia, prevenire le ricorrenze e limitare il periodo in cui il virus viene liberato, ma attualmente non esistono misure di controllo di popolazione efficaci come ad esempio un vaccino. Un vaccino ideale dovrebbe essere in grado di eradicare, eliminare o contenere l’agente infettivo; un vaccino preventivo contro HSV non solo dovrebbe prevenire l’infezione genitale primaria, ma dovrebbe ridurre o limitare il rischio di infezione a livello del sistema nervoso. Sulla base di queste conoscenze, abbiamo sviluppato una strategia vaccinale che si basa sull’utilizzo di un vettore lentivirale derivato dal virus dell’immunodeficienza felina e codificante per la glicoproteina B di HSV-1 come immunogeno (LAW-gB1). Questo gene è stato scelto per la sua capacità di indurre una immunità crociata contro HSV-1 e HSV-2 sia di tipo umorale che cellulare e per la sua spiccata abilità nello stimolare una risposta di tipo cellulo-mediata, che sembra essere di fondamentale importanza nel contenere l’infezione erpetica. Per massimizzare ed ampliare l’efficienza di trasduzione, LAW-gB1 è stato prodotto e pseudotipizzato con diversi envelope, ed inizialmente caratterizzato in vitro su diversi tipi cellulari per valutare lo spettro di traduzione e la durata di espressione del transgene. LAW-gB1 è stato poi inoculato in topi C57BL/6 e testato per la sua capacità di indurre sia una risposta umorale che cellulo-mediata verso l’antigene vaccinale. La vaccinazione ha indotto, nella milza, nei linfonodi inguinali e nel midollo osseo, linfociti T CD8+ specifici che risultavano assenti nei topi di controllo inoculati con il vettore vuoto. Inoltre, la risposta immunitaria specifica si è dimostrata durevole ed è anche incrementata con il susseguirsi degli inoculi. Anche la risposta umorale si è mantenuta a titoli elevati per tutta la durata del protocollo di immunizzazione. Il passo successivo è stata la valutazione della protezione, in seguito ad un challenge intravaginale, contro dei ceppi virulenti di HSV-1 e di HSV-2, quest’ultimo somministrato anche ad una dose elevata. Questi studi hanno dimostrato che LAW-gB1 è capace di indurre elevati livelli di protezione nei confronti di entrambi i virus. Inoltre, gli animali vaccinati che, in seguito al challenge, non presentavano virus nel tampone vaginale, non avevano sviluppato anticorpi contro HSV ed avevano resistito all’infezione, non hanno nemmeno mostrato alcun segno di herpes genitale dopo la somministrazione di una dose elevata di ciclofosfamide che ha depletato più dell’80% dei linfociti circolanti ed è stata in grado di riattivare l’infezione negli animali di controllo mock-vaccinati e naïve, dimostrando così l’assenza di virus latente a livello del sistema nervoso. Per concludere, è stato anche effettuato un protocollo di immunizzazione nel quale è stato combinato l’utilizzo del vettore LAW-gB1 con un vettore ricombinante derivato dal virus vaccinico modificato Ankara (MVA) e codificante la stessa gB1; anche in questo protocollo, il vaccino si è dimostrato altrettanto promettente Questi risultati hanno dimostrato come lo sviluppo di strategie profilattiche contro l’herpes genitale sia una strada percorribile e che il vettore LAW-gB1 ha tutte le potenzialità per essere un buon candidato vaccinale

Allestimento di un protocollo vaccinale contro herpes simplex virus

Gli herpes simplex virus (HSV-1 e HSV-2) sono virus a DNA notevolmente diffusi che provocano infezioni che possono dare latenza e ricorrenza. Il primo sierotipo è responsabile della comparsa di vescicole febbrili caratteristiche che di norma interessano la zona facciale (labbra, narici) mentre il secondo provoca un'infezione con manifestazioni analoghe a livello genitale, nota anche come herpes genitalis. Tuttavia negli ultimi anni, principalmente a causa del cambiamento dei costumi sessuali, questa divisione non è più così netta tanto che l’isolamento di HSV-1 da lesioni genitali è un evento molto frequente. Negli ultimi 25 anni si è assistito un incremento di oltre il 30% nell’incidenza di HSV genitale portando così l’infezione provocata da questi virus al quinto posto nella graduatoria mondiale delle infezioni sessualmente trasmesse. La messa a punto di una profilassi vaccinale che induca una sufficiente risposta cellulo-mediata sembra essere la via più promettente per un efficace contenimento dell’infezione, tuttavia ad oggi i vaccini anti-HSV non hanno dato risultati soddisfacenti. Su queste premesse, il mio lavoro di tesi ha come obiettivo lo sviluppo di un vaccino contro HSV utilizzando un vettore lentivirale di terza generazione del tipo self-inactivating. In particolare il vettore si basa sul sistema “split-component” che consiste nella separazione del genoma virale in tre plasmidi diversi (envelope, packaging e vettore di trasferimento) per evitare possibili rischi di ricombinazione con conseguente generazione di particelle virali infettanti. Ad ulteriore garanzia di sicurezza il vettore utilizzato è stato prodotto a partire dal virus dell’immunodeficienza felina (FIV), un lentivirus che causa nel gatto una patologia simile all’immunodeficienza umana, ma che non infetta nè causa patologia nell’uomo. Per il protocollo di vaccinazione, all’interno del vettore FIV-derivato è stata clonata la glicoproteina B di HSV-1 (gB), questa oltre ad essere una proteina strutturale che esplica la funzione di recettore è anche un antigene altamente immunogeno. Inoltre gB è capace di indurre una attività protettiva anche contro HSV-2 e questo la rende più adatta, rispetto ad altre proteine virali, per un protocollo di vaccinazione contro entrambi i sierotipi. I vettori sono stati caratterizzati in vitro per l’efficienza di trasfezione e traduzione su diversi tipi cellulari. È stata quindi effettuata la messa a punto del protocollo di vaccinazione, a questo scopo il vettore è stato inoculato in topi C57BL/6 e la risposta cellulo-mediata è stata valutata con saggi immunologici precedentemente testati per la loro funzionalità ai fini dell’individuazione di questo tipo di risposta. La vaccinazione ha dimostrato attivare una risposta CD8 specifica nei confronti di gB, assente invece nei controlli. La valutazione dell’andamento nel tempo ha inoltre dimostrato che la risposta è duratura nel tempo. Per questo motivo, saranno previste nel nostro laboratorio ulteriori ricerche atte ad aumentare ulteriormente l’immunogenicità del vettore ai fini della produzione di un vaccino ancora più efficiente

Neutralization of Human Cytomegalovirus Entry into Fibroblasts and Epithelial Cells

Human cytomegalovirus (HCMV) is a leading cause of permanent birth defects, highlighting the need to develop an HCMV vaccine candidate. However, HCMV vaccine development is complicated by the varying capacity of neutralizing antibodies (NAb) to interfere in vitro with the HCMV entry routes mediating infection of fibroblast (FB) and epithelial cells (EC). While HCMV infection of FB and EC requires glycoprotein complexes composed of gB and gH/gL/gO, EC infection depends additionally on the envelope pentamer complex (PC) composed of gH, gL, UL128, UL130 and UL131A. Unlike NAb to gB or gH epitopes that can interfere with both FB and EC infection, NAb targeting predominantly conformational epitopes of the UL128/130/131A subunits are unable to prevent FB entry, though they are highly potent in blocking EC infection. Despite the selective requirement of the PC for EC entry, the PC is exceptionally immunogenic as vaccine antigen to stimulate both EC- and FB-specific NAb responses due to its capacity to elicit NAb that target epitopes of the UL128/130/131A subunits and gH. These findings suggest that the PC could be sufficient in a subunit vaccine formulation to induce robust FB- and EC-specific NAb responses. In this short review, we discuss NAb responses induced through natural infection and vaccination that interfere in vitro with HCMV infection of FB and EC

Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology

No matter what their origin, strain and family, viruses have evolved exquisite strategies to reach and penetrate specific target cells where they hijack the cellular machinery to express viral genes and produce progeny particles. The ability to deliver and express genetic information to cells is the basis for exploiting viruses as "Trojan horses" to genetically modify the natural cell target or, upon manipulation of the viral receptor to retarget the virus, to genetically engineer different cell types. This process, known as transduction, is accomplished using viral vectors derived from parental wild type viruses whose viral genes, essential for replication and virulence, have been replaced with the heterologous gene(s) required for cell manipulation. Rearrangement of the viral genome to impede replication or generation of infectious virions but maintaining the ability to deliver nucleic acids has been the object of intense research since the early 1980s. Technological advances and the ever-growing knowledge of molecular virology and virus-host cell relationships have constantly improved the safety profile of viral vectors that are now used in vitro and in vivo to study cellular gene function, correct genetic defects (gene therapy), express therapeutic proteins, vaccinate against infectious agents and tumors, produce experimental animal models, and for other purposes. This review illustrates the strategies used to generate some of the most used viral vectors, and their advantages, limitations and principal applications

Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology.

No matter what their origin, strain and family, viruses have evolved exquisite strategies to reach and penetrate specific target cells where they hijack the cellular machinery to express viral genes and produce progeny particles. The ability to deliver and express genetic information to cells is the basis for exploiting viruses as “Trojan horses” to genetically modify the natural cell target or, upon manipulation of the viral receptor to retarget the virus, to genetically engineer different cell types. This process, known as transduction, is accomplished using viral vectors derived from parental wild type viruses whose viral genes, essential for replication and virulence, have been replaced with the heterologous gene(s) required for cell manipulation. Rearrangement of the viral genome to impede replication or generation of infectious virions but maintaining the ability to deliver nucleic acids has been the object of intense research since the early 1980s. Technological advances and the ever-growing knowledge of molecular virology and virus-host cell relationships have constantly improved the safety profile of viral vectors that are now used in vitro and in vivo to study cellular gene function, correct genetic defects (gene therapy), express therapeutic proteins, vaccinate against infectious agents and tumors, produce experimental animal models, and for other purposes. This review illustrates the strategies used to generate some of the most used viral vectors, and their advantages, limitations and principal applications

Identification of a Continuous Neutralizing Epitope within UL128 of Human Cytomegalovirus.

As human cytomegalovirus (HCMV) is the most common infectious cause of fetal anomalies during pregnancy, development of a vaccine that prevents HCMV infection is considered a global health priority. Although HCMV immune correlates of protection are only poorly defined, neutralizing antibodies (NAb) targeting the envelope pentamer complex (PC) composed of the subunits gH, gL, UL128, UL130, and UL131A are thought to contribute to the prevention of HCMV infection. Here, we describe a continuous target sequence within UL128 that is recognized by a previously isolated potent PC-specific NAb termed 13B5. By using peptide-based scanning procedures, we identified a 13-amino-acid-long target sequence at the UL128 C terminus that binds the 13B5 antibody with an affinity similar to that of the purified PC. In addition, the 13B5 binding site is universally conserved in HCMV, contains a previously described UL128/gL interaction site, and interferes with the 13B5 neutralizing function, indicating that the 13B5 epitope sequence is located within the PC at a site of critical importance for HCMV neutralization. Vaccination of mice with peptides containing the 13B5 target sequence resulted in the robust stimulation of binding antibodies and, in a subset of immunized animals, in the induction of detectable NAb, supporting that the identified 13B5 target sequence constitutes a PC-specific neutralizing epitope. These findings provide evidence for the discovery of a continuous neutralizing epitope within the UL128 subunit of the PC that could be an important target of humoral immune responses that are involved in protection against congenital HCMV infection.IMPORTANCE Neutralizing antibodies (NAb) targeting the human cytomegalovirus (HCMV) envelope pentamer complex (PC) are thought to be important for preventing HCMV transmission from the mother to the fetus, thereby mitigating severe developmental disabilities in newborns. However, the epitope sequences within the PC that are recognized by these potentially protective antibody responses are only poorly defined. Here, we provide evidence for the existence of a highly conserved, continuous, PC-specific epitope sequence that appears to be located within the PC at a subunit interaction site of critical importance for HCMV neutralization. These discoveries provide insights into a continuous PC-specific neutralizing epitope, which could be an important target for a vaccine formulation to interfere with congenital HCMV infection