Herstellung von Knock-out-Mäusen für das endoplasmatische Retikulumprotein 28 (ERp28) und Struktur- und Funktionsanalyse seines Drosophila Homologs Wind

Meine Arbeit umfasst zwei Teile: (1) die Erstellung von knock-out Mäusen für Erp28, ein Gen, welches für ein Chaperone des Endoplasmatischen Reticulums kodiert, (2) die strukturelle und funktionelle Analyse von Wind, das ERp28-Homolog von Drosophila. Um eine ERp28 Knock-out Maus zu erstellen, musste zuerst die Genstruktur (Exonverteilung) von ERp28 etabliert werden. Danach wurde eine genomische Bibliothek von Mäusen mit 32P-markierten cDNA-Fragmenten gescreent, und zwei positive Klone, die den Genlokus von ERp28 enthalten, isoliert. Eine Restriktions karte vom Genlokus wurde erstellt. Das Gen für ERp28 hat eine einfache Struktur mit nur drei Exons. Das erste Exon enthält das Start codon ATG und das dritte das Stopcodon TGA. Fast die gesamte D-Domäne, die einzigartig für die Unterfamilie von PDI-D Proteinen ist, wird vom dritten Exon kodiert. Bei der RT-PCR für die Klonierung der cDNA von ERp78, habe ich möglicherweise eine alternative splice form von ERp28 entdeckt, in welcher das zweite Exon ausgeschnitten ist. Diese cDNA konnte auch bei Mensch und Ratte gefunden werden, nicht aber bei Drosophila, was auf eine limitierte Verbreitung bei verschiedenen Species hindeutet. Weitere Studien müssen aber gemacht werden, um die Existenz dieser alternativen splice Form zu bestätigen und zu charakterisieren. Auf der Basis der Genstruktur und des Restriktionsverdaus des ERp28- Locus, wurde ein knock-out (KO) Vektor erstellt und in ES-Zellen transfiziert. Drei positive Rekombinanten wurden durch Selektion mit Antibiotika und PCR-Screening erhalten. Chimere Mäuse wurden nach Microinjektion von zwei dieser 3 Klone in Mausblastocysten generiert. Heterozygote Mäuse wurden dann durch Paarung von männliche Chimeren und weiblichen C57BL6N Wildtypmäusen erstellt.Homozygoten wurden dann durch erneute Kreuzung von Heterozygoten erstellt. Durch Genotypiserung in PCR-Analysen und/oder Southern Blot wurden Chimeren, Heterozygoten und Homozygoten charakterisiert. Zur Zeit habe ich auch keinen auffälligen Phenotyp von -/- Homozygoten entdeckt. Deswegen werden, um die Funktion von ERp28 zu klären, detailierte Analysen gemacht. Immunologische Studien zeigen, dass obwohl ERp28 in verschieden Geweben und Organen exprimiert wird, es in E12 embryos in einigen spezifischen Geweben und Zellen relativ stärkes exprimiert wird, zum Beispiel in Glialzellen im Gehirn, im plexüs choreoideüs der weiterer Ventrikel und im Heren. Diese Beobachtungen stellen wichtige Informationen für eine genaüere phänotypische Analyse dar.Im 2. Teil meiner Arbeit sollte das PDI-Dß-Protein Wind kristallisiert werden. Da eine Kristallisation von Erp28 bisher nicht möglich war, konzentrierte ich mich auf sein Homolog Wind. Wind spielt eine wichtige Rolle in der Dorsoventral-Entwicklung in Drosophila Embryonen. Kürzlich wurde gezeigt, dass es für die richtige Lokalisation von Pipe, einem Schlüsselfaktor in der Dorsoventral-Entwicklung, essentiell ist. Die Kristallisation dieses Proteins wurde in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Strukturchemie der Universität Göttingen ( Prof. Dr. Sheldrick) durchgeführt. Das Wind-Protein konnte bei einer Auflösung von 1,9 Ả kristallisiert werden. Wie sich zeigte, liegt es als Homodimer vor. Jedes Monomer besteht aus 2 unterschiedlichen Domänen: einer N-terminalen Domäne mit Ähnlichkeit zu Thioredoxin und einer C-terminal gelegenen D-Domäne. Das Dimer wird allein durch die Beteiligung der Thioredoxin-ähnlichen Domäne gebildet. In der N-terminalen Domäne liegt ein charakteristisches Strukturelement vor bestehend aus ßaßaßaßßa, welches dem Thioredoxinfold zugeordnet wird. Die D-Domäne hingegen besteht nur aus 5 a-Helices. Durch die Homodimerisierung entsteht ein tiefer, negativ geladener Dimerspalt, in welchem kleiner Peptide gebunden werden könnten. Auf der Oberfläche von Wind gibt es konservierte Aminosäuren. Ergebnisse aus Strukturanalyse, biochemischen Experimenten sowie Mutagenesestudien lassen auf eine mögliche Substrat-Bindestelle um Y55 in der Thioredoxin-Domäne herum schliessen, (Ma et al., 2003).Durch Insulin Reduktionsexperimente und Mutagenese konnten wir zeigen, dass das vorhandene CTGC-Motiv in der N-terminalen Domäne von Wind redox-inaktiv und nicht für den Transport von Pipe vom ER zum Golgi erforderlich ist. Daraus kann man folgern, dass es sich bei Wind um ein redox-unabhängiges Chaperon/ Escortprotein handelt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass obwohl die b- und die D-Domäne für die Funktion von Wind wichtig sind die D-Domäne von Wind durch die seines Maus-Homologs Erp28 ersetzt werden konnte, ohne den Transport von Pipe zu beeinflussen. Dieses lässt auf eine ähnliche oder sogar gleiche Funktion der D-Domäne schliessen.Die Ergebnisse aus den Wind-Studien gaben wichtige Informationen zur Funktion von Erp28. Weiterhin sei betont, dass es sich bei der Kristallisierung von Wind um die erste Kristallstruktur eines PDI-verwandten Proteins im ER handelt. Die Struktur und die mögliche Substrat-Bindestelle, die in dieser Arbeit aufgeklärt wurden, können wichtige Hinweise geben für die Funktionen anderer PDI-Proteine

Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease

The embryonic process of forming a complex structure such as the heart remains poorly understood. Here, we show that Six2 marks a dynamic subset of second heart field progenitors. Six2-positive (Six2+) progenitors are rapidly recruited and assigned, and their descendants are allocated successively to regions of the heart from the right ventricle (RV) to the pulmonary trunk. Global ablation of Six2+ progenitors resulted in RV hypoplasia and pulmonary atresia. An early stage-specific ablation of a small subset of Six2+ progenitors did not cause any apparent structural defect at birth but rather resulted in adult-onset cardiac hypertrophy and dysfunction. Furthermore, Six2 expression depends in part on Shh signaling, and Shh deletion resulted in severe deficiency of Six2+ progenitors. Collectively, these findings unveil the chronological features of cardiogenesis, in which the mammalian heart is built sequentially by temporally distinct populations of cardiac progenitors, and provide insights into late-onset congenital heart disease

A Tbx1-Six1/Eya1-Fgf8 genetic pathway controls mammalian cardiovascular and craniofacial morphogenesis

Shared molecular programs govern the formation of heart and head during mammalian embryogenesis. Development of both structures is disrupted in human chromosomal microdeletion of 22q11.2 (del22q11), which causes DiGeorge syndrome (DGS) and velo-cardio-facial syndrome (VCFS). Here, we have identified a genetic pathway involving the Six1/Eya1 transcription complex that regulates cardiovascular and craniofacial development. We demonstrate that murine mutation of both Six1 and Eya1 recapitulated most features of human del22q11 syndromes, including craniofacial, cardiac outflow tract, and aortic arch malformations. The mutant phenotypes were attributable in part to a reduction of fibroblast growth factor 8 (Fgf8), which was shown to be a direct downstream effector of Six1 and Eya1. Furthermore, we showed that Six1 and Eya1 genetically interacted with Fgf8 and the critical del22q11 gene T-box transcription factor 1 (Tbx1) in mice. Together, these findings reveal a Tbx1-Six1/Eya1-Fgf8 genetic pathway that is crucial for mammalian cardiocraniofacial morphogenesis and provide insights into the pathogenesis of human del22q11 syndromes

Congenital sideroblastic anemia due to mutations in the mitochondrial HSP70 homologue <i>HSPA9</i>

The congenital sideroblastic anemias (CSAs) are relatively uncommon diseases characterized by defects in mitochondrial heme synthesis, iron-sulfur (Fe-S) cluster biogenesis, or protein synthesis. Here we demonstrate that mutations in HSPA9, a mitochondrial HSP70 homolog located in the chromosome 5q deletion syndrome 5q33 critical deletion interval and involved in mitochondrial Fe-S biogenesis, result in CSA inherited as an autosomal recessive trait. In a fraction of patients with just 1 severe loss-of-function allele, expression of the clinical phenotype is associated with a common coding single nucleotide polymorphism in trans that correlates with reduced messenger RNA expression and results in a pseudodominant pattern of inheritance