Etude de l'évolution du potentiel génétique de populations bactériennes dégradant l'atrazine

Atrazine, one of the most used herbicide to control the development of weeds in crop, has led to the contamination of the environment. Repeated exposure to this herbicide resulted in the emergence of microbial populations able to degrade atrazine and to use it as a nitrogen source for its growth. These microbial populations are responsible for accelerated biodegradation of atrazine (BDA), a key ecosystemic service diminishing the persistence of this herbicide in the environment. The aim of this PhD work was to study genetic and physiological mechanisms responsible for functioning and improving of this ecosystemic service. We applied an experimental approach starting from genes to communities degrading atrazine in order to identify processes of adaptation involved in the evolution of accelerated biodegradation function.The first part of the PhD aimed at evaluating the importance of accumulation of single mutations in the atzA gene for the activity of AtzA transforming atrazine to hydroxyatrazine. Sequencing or atzA genes amplified from different atrazine-degrading isolates (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps and differents Chelatobacter heintzii) showed that atzA sequence was conserved. However, four non synonymous mutations were identified (1 for Pseudomonas sp. ADP Ps and 3 for Chelatobacter heintzii). Modeling of AtzA structure showed that three mutations were located in important regions (active site, interaction with atrazine and with the metal Fe2+). [...] The second part aimed at studying the plasticity of the atrazine-degrading pathway in two opposed conditions: (i) one aiming at evaluating the persistence of degrading capability in absence of selection pressure and (ii) a second one aiming at evaluating the evolution of degrading capability under high selection pressure exerted by atrazine. With these aims, experimental evolutions were carried out with Pseudomonas sp. ADP. (i) We showed that cyanuric acid exposure led to the selection of a newly-evolved population characterized by increased growing ability on culture medium containing this substance as nitrogen source. This population is characterized by the deletion of a 47 kb region containing atzABC genes from ADP1. We showed that increased fitness of newly-evolved population was due to the selective loss of the genetic burden represented by the 47 kb region, the cyanuric acid degrading ability remaining unchanged. (ii) Atrazine exposure led to the selection of population characterized by the insertion of ADP1 plasmid in the bacterial chromosome. [...] The third part aimed at developing a tool allowing monitoring the evolution of atrazine-degrading genetic potential at the scale of a synthetic microbial community. To do so four degrading strains among which, one was isolated in this study, were chosen. [...] Altogether, these results showed that the atrazine accelerated biodegradation function is highly versatile and under constant evolution. Furthermore, they highlight that the exposure to atrazine is the key parameter driving the evolution of degrading populationL'atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l'environnement. L'exposition chronique à cet herbicide a conduit à l'émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l'atrazine et de l'utiliser comme une source d'azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l'atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l'environnement. L'objectif de ce travail était d'étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l'amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d'identifier les processus adaptatifs impliqués dans l'évolution de la fonction de BDA de l'atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l'importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l'atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l'atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l'atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l'atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l'évolution de la capacité de dégradation en présence d'une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d'évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L'exposition à l'acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l'atrazine, a conduit à la sélection d'une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l'acide cyanurique comme source d'azote. Cette population est caractérisée par une délétion d'une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l'acide cyanurique restant inchangée. (ii) L'exposition à l'atrazine a conduit à la sélection d'une populationnouvellement évoluée caractérisée par l'insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d'évaluer, à l'échelle d'une communauté microbienne synthétique, l'évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l'atrazine est très versatile et qu'elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d'exposition des populations dégradantes au pesticide

Bacteriophages vehiculate a high amount of antibiotic resistance determinants of bacterial origin in the Orne River ecosystem

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Etude de l'évolution du potentiel génétique de populations bactériennes dégradant l'atrazine

L atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l environnement. L exposition chronique à cet herbicide a conduit à l émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l atrazine et de l utiliser comme une source d azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l environnement. L objectif de ce travail était d étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d identifier les processus adaptatifs impliqués dans l évolution de la fonction de BDA de l atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l évolution de la capacité de dégradation en présence d une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L exposition à l acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l atrazine, a conduit à la sélection d une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l acide cyanurique comme source d azote. Cette population est caractérisée par une délétion d une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l acide cyanurique restant inchangée. (ii) L exposition à l atrazine a conduit à la sélection d une populationnouvellement évoluée caractérisée par l insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d évaluer, à l échelle d une communauté microbienne synthétique, l évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l atrazine est très versatile et qu elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d exposition des populations dégradantes au pesticide.Atrazine, one of the most used herbicide to control the development of weeds in crop, has led to the contamination of the environment. Repeated exposure to this herbicide resulted in the emergence of microbial populations able to degrade atrazine and to use it as a nitrogen source for its growth. These microbial populations are responsible for accelerated biodegradation of atrazine (BDA), a key ecosystemic service diminishing the persistence of this herbicide in the environment. The aim of this PhD work was to study genetic and physiological mechanisms responsible for functioning and improving of this ecosystemic service. We applied an experimental approach starting from genes to communities degrading atrazine in order to identify processes of adaptation involved in the evolution of accelerated biodegradation function.The first part of the PhD aimed at evaluating the importance of accumulation of single mutations in the atzA gene for the activity of AtzA transforming atrazine to hydroxyatrazine. Sequencing or atzA genes amplified from different atrazine-degrading isolates (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps and differents Chelatobacter heintzii) showed that atzA sequence was conserved. However, four non synonymous mutations were identified (1 for Pseudomonas sp. ADP Ps and 3 for Chelatobacter heintzii). Modeling of AtzA structure showed that three mutations were located in important regions (active site, interaction with atrazine and with the metal Fe2+). [...] The second part aimed at studying the plasticity of the atrazine-degrading pathway in two opposed conditions: (i) one aiming at evaluating the persistence of degrading capability in absence of selection pressure and (ii) a second one aiming at evaluating the evolution of degrading capability under high selection pressure exerted by atrazine. With these aims, experimental evolutions were carried out with Pseudomonas sp. ADP. (i) We showed that cyanuric acid exposure led to the selection of a newly-evolved population characterized by increased growing ability on culture medium containing this substance as nitrogen source. This population is characterized by the deletion of a 47 kb region containing atzABC genes from ADP1. We showed that increased fitness of newly-evolved population was due to the selective loss of the genetic burden represented by the 47 kb region, the cyanuric acid degrading ability remaining unchanged. (ii) Atrazine exposure led to the selection of population characterized by the insertion of ADP1 plasmid in the bacterial chromosome. [...] The third part aimed at developing a tool allowing monitoring the evolution of atrazine-degrading genetic potential at the scale of a synthetic microbial community. To do so four degrading strains among which, one was isolated in this study, were chosen. [...] Altogether, these results showed that the atrazine accelerated biodegradation function is highly versatile and under constant evolution. Furthermore, they highlight that the exposure to atrazine is the key parameter driving the evolution of degrading populationDIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Evolution of genetic degradation potential of pesticide-degrading bacterial communities

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Amélioration de la compétitivité d’une population bactérienne dégradant l’atrazine, liée à une perte de gènes

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Catching change in microbial diversity indicators under different soil organic matter managements: Higher taxonomic resolution, better discrimination?

International audienceRecent advances in molecular ecology have dramatically improved our knowledge of soil microbial diversity and offers new indicators of soil quality. The usefulness of diversity indices has never been greater as the astronomical amounts of data generated in the literature needs to be synthesized. Despite technical guidelines have been proposed to characterize soil microbiomes using high throughput sequencing, the effect of taxonomic resolution on diversity indices is still largely unknown. Here, we explored how downscaling to higher taxonomic resolution levels may affect α- and β-diversity indices of bacterial communities exposed to different soil organic matter management. To this aim, we collected soil samples in a long-term experimental site (Ultuna, Sweden) where different mineral and organic fertilizers have been applied for since 1956. We used both massive amplicon sequencing from phylum to species (OTU) and molecular fingerprints (PLFA, DGGE and T-RFLP). Our results showed that the discrimination potential increased at finer taxonomic resolution for β-diversity but not for α-diversity indices such as richness and evenness. Also, the relative importance of hierarchical drivers of soil microbial communities such as C, N and pH varied depending on the taxonomic resolution. This study also demonstrated that indicators generated by molecular fingerprints such as PLFA, DGGE and T-RFLP are still consistent to monitor the effect of agricultural management on β-diversity but not on α-diversity, which is useful information as it allows for a better use of results in past literature. We encourage performing such comparative studies on wider surveys, including different contexts and other indicators, in order to increase the efficiency and the robustness of the use of sequencing data in soil biodiversity monitorin

Genetic plasticity of atrazine-degrader: evidence for the deletion of atzABC genes in pseudomonas sp. adp in response to cyanuric acid selection pressure

International audienceSeveral bacterial strains are known to metabolize s-triazines herbicides among which atrazine reported worldwidel to contaminate soil and water resources. The complete mineralization of atrazine to carbon dioxide and ammonium is catalyzed by 6 hydrolytic enzymes encoded by atzABCDEF genes located on the plasmid pADP1 in Pseudomonas ADP. The atzABC genes code for the upper pathway transforming atrazine to cyanuric acid, while the atzDEF genes code for the lower pathway transforming cyanuric acid to simple compounds. In order to study the genetic plasticity of the atrazine catabolic pathway, we performed an in vitro evolution study consisting in applying a continuous selection pressure with cyanuric acid as sole nitrogen source on Pseudomonas sp. After in vitro evolution the cyanuric acid degradation potential using HPLC analysis, of the native and of the newly-evolved Pseudomonas sp. population was assessed. Characterization of genetic potential revealed that the atzABC sequences were deleted in the newly-evolved population, probably by homologous recombination mediated by IS sequences. As a consequence, this in vitro evolution experiment suggests that the selection pressure exerted by the cyanuric acid led to the selection of a population showing a better fitness towards this metabolite, due to the loss of a genetic overload

Importance of genetic plasticity for microbial adaptation to pesticide biodegradation: in vitro evolution of Pseudomonas sp. ADP under atrazine or cyanuric acid selection pressure as case studies

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In vitro evolution of an atrazine-degrading population under cyanuric acid selection pressure: Evidence for the selective loss of a 47 kb region on the plasmid ADP1 containing the atzA, B and C genes

International audienceThe adaptation of microorganisms to pesticide biodegradation relies on the recruitment of catabolic genes by horizontal gene transfer and homologous recombination mediated by insertion sequences (IS). This environment-friendly function is maintained in the degrading population but it has a cost which could diminish its fitness. The loss of genes in the course of evolution being a major mechanism of ecological specialization, we mimicked evolution in vitro by sub-culturing the atrazine-degrading Pseudomonas sp. ADP in a liquid medium containing cyanuric acid as the sole source of nitrogen. After 120 generations, a new population evolved, which replaced the original one. This new population grew faster on cyanuric acid but showed a similar cyanuric acid degrading ability. Plasmid profiles and Southern blot analyses revealed the deletion of a 47 kb region from pADP1 containing the atzABC genes coding for the enzymes that turn atrazine into cyanuric acid. Long PCR and sequencing analyses revealed that this deletion resulted from a homologous recombination between two direct repeats of a 110-bp, identical to ISPps1 of Pseudomonas huttiensis, flanking the deleted 47 kb region. The loss of a region containing three functional genes constitutively expressed thereby constituting a genetic burden under cyanuric acid selection pressure was responsible for the gain in fitness of the new population. It highlights the IS-mediated plasticity of the pesticide-degrading potential and shows that IS not only favours the expansion of the degrading genetic potential thanks to dispersion and duplication events but also contribute to its reduction thanks to deletion events

Ongoing functional evolution of the bacterial atrazine chlorohydrolase AtzA

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