Molecular and structural study of Porcin Endogenous RetroVirus integrase and its human cellular cofactor Brd2, for the prevention of retroviral xenozoonosis

L’utilisation d’organes porcins pourrait pallier le déficit d’organes humains pour les patients en attente de greffe. Le développement de cette technique est cependant limité par la présence d’un rétrovirus endogène actif dans le génome des cellules porcines. L’intégrase (IN) du rétrovirus recombinant endogène porcin PERV-A/C catalyse une étape clé du cycle rétroviral et constitue une cible thérapeutique de choix. Cette IN utilise un cofacteur cellulaire, la protéine Brd2, qui permet le ciblage de sites d’intégration spécifiques et une infection productive. La première partie du manuscrit porte sur l’étude biochimique et structurale de la zone d’interaction entre l’IN de PERV-A/C et la protéine Brd2 humaine. Des acides aminés essentiels pour l’interaction ont été caractérisés et une enveloppe SAXS a été déterminée. Ces résultats ont permis de mieux comprendre le mécanisme d’interaction et de proposer un modèle structural de l’intasome des Gammarétrovirus avec un fragment de Brd2 lié. Un protocole de purification de cet assemblage macromoléculaire a ensuite été mis au point et des images de microscopie électronique ont été enregistrées. Un criblage de molécules candidates pour inhiber la formation du complexe intasome:Brd2 a également été réalisé, dans le but de développer une thérapie réduisant les risques de xénozoonoseXenotransplantation is the transplantation of organs, tissues or cells from an animal to a human recipient and appears to be a promising option regarding the lack of human donors. Research is now focusing on pig donors, but this animal carries an active endogenous Gammaretrovirus, termed PERV (Porcin Endogenous RetroVirus), able to infect patients. Recombinant PERV-A/C IN is a key enzyme of the retroviral life cycle and a relevant therapeutic target. IN requires a cellular cofactor, the human protein Brd2, which allows to target specific integration sites and is mandatory for a productive infection. During this thesis, residues essential for the IN:Brd2 interaction were identified and a SAXS envelope of a two fragments complex were determined. With the support of these experimental results, a first model of the gammaretroviral intasome with a bound Brd2 fragment was built. Finally, a purification protocol of this macromolecular assembly was set-up and electron microscopy images were collected. A first screening of putative IN:Brd2 interaction modulators was carried out with the purpose of developing a therapy limiting xenozoonosis risk

Étude moléculaire et structurale de l’intégrase du virus porcin PERV et de son partenaire cellulaire humain Brd2, dans le cadre de la prévention de xénozoonoses rétrovirales

Xenotransplantation is the transplantation of organs, tissues or cells from an animal to a human recipient and appears to be a promising option regarding the lack of human donors. Research is now focusing on pig donors, but this animal carries an active endogenous Gammaretrovirus, termed PERV (Porcin Endogenous RetroVirus), able to infect patients. Recombinant PERV-A/C IN is a key enzyme of the retroviral life cycle and a relevant therapeutic target. IN requires a cellular cofactor, the human protein Brd2, which allows to target specific integration sites and is mandatory for a productive infection. During this thesis, residues essential for the IN:Brd2 interaction were identified and a SAXS envelope of a two fragments complex were determined. With the support of these experimental results, a first model of the gammaretroviral intasome with a bound Brd2 fragment was built. Finally, a purification protocol of this macromolecular assembly was set-up and electron microscopy images were collected. A first screening of putative IN:Brd2 interaction modulators was carried out with the purpose of developing a therapy limiting xenozoonosis risksL’utilisation d’organes porcins pourrait pallier le déficit d’organes humains pour les patients en attente de greffe. Le développement de cette technique est cependant limité par la présence d’un rétrovirus endogène actif dans le génome des cellules porcines. L’intégrase (IN) du rétrovirus recombinant endogène porcin PERV-A/C catalyse une étape clé du cycle rétroviral et constitue une cible thérapeutique de choix. Cette IN utilise un cofacteur cellulaire, la protéine Brd2, qui permet le ciblage de sites d’intégration spécifiques et une infection productive. La première partie du manuscrit porte sur l’étude biochimique et structurale de la zone d’interaction entre l’IN de PERV-A/C et la protéine Brd2 humaine. Des acides aminés essentiels pour l’interaction ont été caractérisés et une enveloppe SAXS a été déterminée. Ces résultats ont permis de mieux comprendre le mécanisme d’interaction et de proposer un modèle structural de l’intasome des Gammarétrovirus avec un fragment de Brd2 lié. Un protocole de purification de cet assemblage macromoléculaire a ensuite été mis au point et des images de microscopie électronique ont été enregistrées. Un criblage de molécules candidates pour inhiber la formation du complexe intasome:Brd2 a également été réalisé, dans le but de développer une thérapie réduisant les risques de xénozoonos

In vitro, in cellulo and structural characterizations of the interaction between the integrase of Porcine Endogenous Retrovirus A/C and proteins of the BET family

Retroviral integrase (IN) proteins catalyze the permanent integration of the viral genome into host DNA. They can productively recruit cellular proteins, and the human Bromodomain and Extra-Terminal domain (hBET) proteins have been shown to be co-factors for integration of gamma-retroviruses such as Murine Leukemia Virus (MLV) into human cells. By using two-hybrid, co-immunoprecipitation and in vitro interaction assays, we showed that IN of the gamma- Porcine Endogenous Retrovirus-A/C (PERV IN) interacts through its C-terminal domain (CTD) with hBET proteins. We observed that PERV IN interacts with the BRD2, BRD3 and BRD4 proteins in vitro and that the BRD2 protein specifically binds and co-localizes with PERV IN protein in the nucleus of cells. We further mapped the interaction sites to the conserved Extra-Terminal (ET) domain of the hBET proteins and to several amino acids of the of the C-terminal tail of the PERV IN CTD. Finally, we determined the first experimental structure of an IN CTD - BET ET complex from small-angle X-ray scattering data (SAXS). We showed that the two factors assemble as two distinct modules linked by a short loop which confers partial flexibility. The SAXS-restrained model is structurally compatible with the binding of the PERV intasome to BRD2. Altogether, these data confirm the important role of host BET proteins in the gamma-retroviruses' targeting site and efficiency of integration