Ex vivo characterization of Breg cells in patients with chronic Chagas disease

Despite the growing importance of the regulatory function of B cells in many infectious diseases, their immunosuppressive role remains elusive in chronic Chagas disease (CCD). Here, we studied the proportion of different B cell subsets and their capacity to secrete IL-10 ex vivo in peripheral blood from patients with or without CCD cardiomyopathy. First, we immunophenotyped peripheral blood mononuclear cells from patients according to the expression of markers CD19, CD24, CD38 and CD27 and we showed an expansion of total B cell and transitional CD24highCD38high B cell subsets in CCD patients with cardiac involvement compared to non-infected donors. Although no differences were observed in the frequency of total IL-10 producing B cells (B10) among the groups, CCD patients with cardiac involvement showed an increased proportion of naïve B10 cells and a tendency to a higher frequency of transitional B10 cells compared to non-infected donors. Our research demonstrates that transitional B cells are greatly expanded in patients with the cardiac form of CCD and these cells retain the ability to secrete IL-10. These findings provide insight into the phenotypic distribution of regulatory B cells in CCD, an important step towards new strategies to prevent cardiomyopathy associated with T. cruzi infection.Fil: Girard, Magalí Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Acevedo, Gonzalo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Ossowski, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Fernández, Marisa. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud "Dr. C. G. Malbrán". Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben"; ArgentinaFil: Hernández, Yolanda. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud "Dr. C. G. Malbrán". Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben"; ArgentinaFil: Chadi, Raúl. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Gomez, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentin

Trypanosoma cruzi Induces Regulatory B Cell Alterations in Patients With Chronic Chagas Disease

The clinical evolution of patients with chronic Chagas disease (CCD) is mainly associated with an excessive inflammation and a defective immunomodulatory profile caused by the interaction between T. cruzi and the host. Regulatory B (Breg) cells exert immune suppression mostly through IL-10 production (B10 cells), but also through IL-10-independent mechanisms. Previously, we demonstrated that CCD patients with cardiomyopathy show changes in the ex vivo Breg cell phenotypic distribution although maintain IL-10 production capacity. Here, we sought to identify potential alterations on Breg cells upon in vitro stimulation. Isolated B cells from CCD patients with or without cardiomyopathy and non-infected (NI) donors were stimulated with T. cruzi lysate or CpG + CD40L, and characterized by flow cytometry based on the expression of CD24, CD27, CD38, and the regulatory molecules IL-10 and PD-L1. IL-10 and IL-17 secretion in the supernatant of B cells was evaluated by ELISA. Data showed that T. cruzi stimulation diminished the expression of CD24 and CD38 on CD27− B cells while reducing the percentage of CD24high inside CD27+ B cells. Furthermore, T. cruzi induced a regulatory B cell phenotype by increasing B10 cells and IL-10 secretion in all the groups. The innate-like B10 cells expansion observed in patients with cardiomyopathy would be associated with CD27− B10 cell subsets, while no predominant phenotype was found in the other groups. Patients with cardiomyopathy also displayed higher IL-17 secretion levels in T. cruzi–activated B cells. CpG + CD40L stimulation revealed that B cells from CCD patients and NI donors had the same ability to differentiate into B10 cells and secrete IL-10 in vitro. Additionally, CCD patients showed an increased frequency of CD24−CD27− B cells and a reduction in the percentage of CD24highCD27+ Breg cells, which appeared to be inversely correlated with the presence of T. cruzi DNA in blood. Finally, CCD patients exhibited a higher frequency of PD-L1+ B cells in T. cruzi–stimulated samples, suggesting that IL-10-independent mechanisms could also be tangled in the control of inflammation. Altogether, our results provide evidence about the potential role of Breg cells in the immune response developed against T. cruzi and its contribution to chronic Chagas cardiomyopathy.Fil: Girard, Magalí Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Ossowski, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Muñoz Calderon, Arturo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Fernández, Marisa. Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén”; ArgentinaFil: Hernandez Vasquez, Yolanda Maria. Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala C; ArgentinaFil: Chadi, Raúl. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Gomez, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentin

Análisis de la activación celular y la expresión de marcadores de respuesta exhausta en linfocitos T de pacientes con enfermedad de Chagas crónica

Los linfocitos T juegan un rol central en la respuesta inmune adaptativa frente a la infección por T. cruzi. En el estadío crónico de la enfermedad de Chagas, se observó que los pacientes tienen una alta frecuencia de células T activadas y que estas son importantes para controlar la parasitemia. Aún así, se ha postulado que la exposición persistente al antígeno puede llevar al desarrollo de un perfil de células T exhaustas donde, entre otras características, hay una mayor expresión de receptores inhibitorios y perdida de funciones efectoras. Adicionalmente, se ha descrito que la frecuencia de células con este perfil tiene relación directa con el desarrollo de patología cardíaca.En el presente trabajo analizamos la activación de linfocitos T mediante el método de marcadores de activación en superficie celular (AIM, por Activation Induced Markers) en pacientes con enfermedad de Chagas crónico y evaluamos la expresión de los marcadores de células exhaustas TIGIT, TIM-3 y LAG-3 en los mismos, cuyo perfil se desconocía hasta el momento. Para esto, células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Chagas crónico, tanto asintomáticos como con cardiopatía, e individuos no infectados con T. cruzi, fueron incubadas por 18-20 h bajo tres condiciones diferentes: ausencia de estímulo antigénico, lisado de tripomastigote-amastigote de T. cruzi y PHA (estímulo antígeno-inespecífico fuerte). Posteriormente se realizó la marcación con anticuerpos y la lectura de resultados por citometría.Se observó una mayor activación de linfocitos T CD4+ en pacientes asintomáticos que en pacientes con cardiopatía y no infectados. Por otra parte la expresión de LAG-3 es mayor en los pacientes con cardiopatía, independientemente del estímulo. A su vez, frente al estímulo con PHA, los pacientes con enfermedad de Chagas crónica presentan una expresión mayor de este marcador comparado con los sujetos no infectados. También de forma independiente del estímulo, tanto TIGIT como TIM-3 presentan una expresión mayor en los pacientes con Chagas y entre ellos es más alta en los pacientes con cardiopatía.En conclusión, el método AIM evidenció una activación diferencial de linfocitos T CD4+ entre los grupos de pacientes con enfermedad de Chagas crónico. Además se observaron diferencias en la expresión de los marcadores TIGIT, TIM-3 y LAG-3 en relación con las manifestaciones cínicas de la enfermedad de Chagas crónica.Fil: Alcaraz, Paula Belén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Girard, Magalí Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Fernández, Marisa. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; ArgentinaFil: Hernández, Yolanda. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; ArgentinaFil: Chadi, Raúl. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Gomez, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Acevedo, Gonzalo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaXXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de ProtozoologíaResistenciaArgentinaSociedad Argentina de Protozoologí

Expression and functionality of co-inhibitory receptors TIGIT, TIM-3 and LAG-3 in CD4+ T cells from patients with chronic Chagas disease

Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, affects 7 million people worldwide, mainly in Latin America where it is endemic. Unless treated early after infection, the disease progresses to a chronic form in which some patients develop cardiac or digestive alterations, while others stay asymptomatic. CD4+ T cell response plays critical and diverse roles during infection, and becomes impaired over time with defective cytokine release. This process known as T cell exhaustion is also defined by the upregulation of inhibitory receptors, mainly PD-1 and CTLA-4. In this work, we aimed to explore the expression of the second line of inhibitory receptors TIGIT, TIM-3 and LAG-3 in parasite stimulated CD4 T cells from patients with different stages of chronic Chagas disease (CCD), and whether their blockade restores cell functionality. Antigen-specific CD4 T cells were identified by activation induced markers (AIM) assay, using the surface molecules Ox40 and CD25. CCD patients, independently of their clinical stage, showed an increased frequency of CD4+TIGIT+ T cells. TIM-3+ CD4+ T cells were more abundant in patients with cardiac manifestations, while LAG-3+ cells were increased in asymptomatic CCD patients, with higher frequency within the non-activated cells subpopulation upon T. cruzi lysate stimulation. Preliminary data showed that TIM-3 blockade tended to increase IFN-g+ CD4+ T cells in CCD patients with cardiomyopathy. Furthermore, in the same group of subjects, the incubation with anti-TIGIT blocking antibody led to a greater frequency of IL-10+ CD4+ T cells compared to the isotype control antibody. Our results highlight the role of the inhibitory receptors TIGIT, TIM-3 and LAG-3 in the modulation of anti-T. cruzi CD4+ T cell responses, in relation with the progression of chronic Chagas disease, and paves the way for the development of novel therapeutic strategies.Fil: Ferragut, Fatima Eneida del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Alcaráz, Paula B.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Chadi, Raul. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Fernandez, Marisa. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; ArgentinaFil: Hernandez Vasquez, Yolanda Maria. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; ArgentinaFil: Gomez, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Acevedo, Gonzalo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaXXXVI Meeting of the Brazilian Society of Protozoology; XLVII Annual Meeting on Basic Research in Chagas’ DiseaseSao PauloBrasilSociedade Brasileira de Protozoologi

CD4+ T cells from chronica Chagas disease patients with different degrees of cardiac compromise exhibit distinct expression patterns of inhibitory receptors TIGIT, TIM-3 and LAG-3

In the chronic stage of Chagas disease, patients show a high frequency of activated T cells. Despite this, persistent presence of antigenic stimulus may affect their functionality and induce an exhausted phenotype with a high expression of inhibitory receptors and loss of effector functions. We hypothesize that inhibitory receptors TIGIT, Tim-3 and Lag-3 may be involved in immune modulation of anti-T. cruzi T cell response.In the present work, we assessed the frequency of CD4+ T cells expressing these receptors and their relation to cellular activation, measured as the expression of activation induced markers (AIM) Ox40 and CD25. Samples from chronic Chagas disease patients (CCD) with different degrees of cardiac compromise (asymptomatic, A, and with cardiopathy, C) and non-infected donors (NI) were analyzed under different stimulation conditions: T. cruzi lysate (Tc), unstimulated, or PHA.We observed statistically significant differences in the frequency of activated (Ox40+CD25+) CD4+ T cells between the CCD and NI subjects when stimulated with Tc. Cells from CCD showed an increased frequency of CD4+TIGIT+ T cells upon stimulation with PHA as compared with the unstimulated condition. CD4+Tim-3+ T cells are more abundant in the circulation of C patients and Lag-3+ cells showed increased frequency in the non-activated subset, within the A group.We demonstrated that the AIM method can be used to detect anti-T.cruzi response in CD4+ T cells, upon in vitro stimulation with Tc. Also, TIGIT, Tim-3 and Lag-3 are expressed differently, or they behave in diverging ways upon in vitro stimulation, in CCD.Fil: Alcaraz, Paula Belén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Girard, Magalí Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Beati, Maria Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Chadi, Raul. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud "Dr. C. G. Malbrán". Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben"; ArgentinaFil: Fernández, Marisa. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Hernandez Vasquez, Yolanda Maria. Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Hospital General de Agudos Doctor Ignacio Pirovano; ArgentinaFil: Gomez, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Acevedo, Gonzalo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaLXVII Reunión Científica Anual de Sociedad Argentina de InmunologíaTucumanArgentinaSociedad Argentina de Inmunologi

Association study between CCR2-CCR5 genes polymorphisms and chronic Chagas heart disease in Wichi and in admixed populations from Argentina.

Several studies have proposed different genetic markers of susceptibility to develop chronic Chagas cardiomyopathy (CCC). Many genes may be involved, each one making a small contribution. For this reason, an appropriate approach for this problematic is to study a large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in individuals sharing a genetic background. Our aim was to analyze two CCR2 and seven CCR5 SNPs and their association to CCC in Argentina. A case-control study was carried out in 480 T. cruzi seropositive adults from Argentinean Gran Chaco endemic region (Wichi and Creole) and patients from Buenos Aires health centres. They were classified according to the Consensus on Chagas-Mazza Disease as non-demonstrated (non-DC group) or demonstrated (DC group) cardiomyopathy, i.e. asymptomatic or with CCC patients, respectively. Since, after allelic analysis, 2 out of 9 studied SNPs did not fit Hardy-Weinberg equilibrium in the unaffected non-DC group from Wichi patients, we analyzed them as a separate population. Only rs1800024T and rs41469351T in CCR5 gene showed significant differences within non-Wichi population (Creole + patients from Buenos Aires centres), being the former associated to protection, and the latter to risk of CCC. No evidence of association was observed between any of the analyzed CCR2-CCR5 gene polymorphisms and the development of CCC; however, the HHE haplotype was associated with protection in Wichi population. Our findings support the hypothesis that CCR2-CCR5 genes and their haplotypes are associated with CCC; however, depending on the population studied, different associations can be found. Therefore, the evolutionary context, in which the genes or haplotypes are associated with diseases, acquires special relevance