Factores interactores como supressores de tRNA mitocondriais mutados

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia MolecularNeste trabalho avaliou-se o efeito de mutações em tRNA mitocondrial humano usando a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Em termos genéricos S. cerevisiae é um microrganismo muito estudado e conhecido, sendo possível modificar o seu genoma de forma rápida e precisa. Como bom modelo permite estudar este tipo de doenças através da mutação dos seus genes que codificam para tRNAs através de um procedimento biobalístico. Com este procedimento é possível introduzir mutações nos genes que codificam para tRNAs mitocondriais da levedura em qualquer posição, incluindo mutações equivalentes às que são patogénicas em humanos. S. cerevisiae é também um bom modelo pois os seus mutantes que exibem deficiências respiratórias, complexas ou muitos graves, têm a capacidade de crescer pois continuam a realizar fermentação em glucose, permitindo assim efectuar estudos funcionais moleculares. Para além do referido, o uso de diferentes estirpes de S. cerevisiae com diferentes mutações permite estudar genes nucleares isolados capazes de suprimir o fenótipo anormal dos mutantes, neste caso o crescimento num meio respirável. Na primeira parte deste projecto caracterizaram-se três estirpes diferentes de S. cerevisiae wild-type, MCC123, D273-10B/1A e W303-1B e subsequentemente o efeito de substituições nos tRNAs mitocondriais com o propósito de definir uma relação entre a eficiência mitocondrial e a presença de diferentes contextos nucleares. Concluiu-se que as estirpes MCC123 e W303-1B são mais apropriadas para o estudo de mutações severas, em contraste a D273-10B/1A é mais adequada para estudar mutações mais leves. Na segunda parte estudou-se a actividade supressora da sobre-expressão dos genes que codificam para leucil-tRNA sintetase, o seu domínio C-terminal e algumas pequenas sequências em diferentes mutantes nos tRNAs incapazes de crescer em meios contendo glicerol (GlnC6T, AspC61T, GlyG30A e HisG51A). A tRNA sintetase inteira (genes de levedura e de humano) e o Cterminal têm alguma capacidade de suprimir o fenótipo anormal, mas o melhor resultado foi obtido sobre-expressando as sequências mais pequenas que codificam para péptidos de quinze aminoácidos do domínio C-terminal (β30-31 e β32-33). Outras sequências testadas não tiveram qualquer efeito supressivo. Também foi caracterizada a capacidade supressora dos factores de elongação da síntese proteica mitocondrial de levedura e humana em células carregando a mutação AspC61T. Os nossos resultados, sobre-expressando tRNA sintetases e factor EF-Tu, mostram que a capacidade catalítica não é necessária para a supressão e sugerimos que esteja envolvida uma catividade tipo chaperone.In this work we evaluate the effect of mitochondrial tRNA mutations using the yeast Saccharomyces cerevisiae as model. This simple organism is good model since it is possible to transform the mitochondria by a biolistic procedure. This makes possible to introduce mutations at any desired position in yeast mt tRNA genes, including mutations equivalent to those that are pathogenic in humans. Yeast offers a unique possibility in that mutants exhibiting complete or very severe respiratory deficiencies can grow by fermentative metabolism on glucose and are therefore amenable to molecular functional studies. Moreover using the yeast strains with the different mutations is possible to isolate nuclear genes able to suppress the defective phenotype of the mutants, in this case to allow the growth on respirable medium (containing glycerol as unique carbon source). In the first part of this project we characterized three different S. cerevisiae wild-type strains, MCC123, D273-10B/A1 and W303-1B and subsequently the effect of mt tRNA substitutions in order to define a relationship between the mitochondrial efficiency and the presence of different nuclear backgrounds. We concluded that MCC123 and W303-1B are more appropriate to study severe mutations whereas the D273-10B/A1 is more suitable to study milder mutations. In the second part of ours experiments we studied the suppression activity overexpressing the mt leucyl-tRNA synthetases genes, it C-terminal domain and some shorter sequences in different tRNA mutants unable to grow in glycerol containing media (GlnC6T, AspC61T, GlyG30A and HisG51A). The entire tRNA synthetases (yeast and human genes) and the C-terminal have some capability of suppress the defective phenotype, but the best result was obtained overexpressing two shorter sequences coding for fifteen aminoacids from its C-terminal domain (β30-31 and β32-33). Other sequences tested did not have any supress effect. I also report a further characterization of the functionality of mt yeast and human mt protein synthesis elongation factors in their suppressing activities in cells bearing the AspC61T mutation. Our results, overexpressing either the tRNA synthetases or the EF-Tu factor, show that the catalytic function is not necessary for suppression and we suggest that a chaperone like activity is involved

The vertebrate Embryo Clock: Common players dancing to a different beat

Vertebrate embryo somitogenesis is the earliest morphological manifestation of the characteristic patterned structure of the adult axial skeleton. Pairs of somites flanking the neural tube are formed periodically during early development, and the molecular mechanisms in temporal control of this early patterning event have been thoroughly studied. The discovery of a molecular Embryo Clock (EC) underlying the periodicity of somite formation shed light on the importance of gene expression dynamics for pattern formation. The EC is now known to be present in all vertebrate organisms studied and this mechanism was also described in limb development and stem cell differentiation. An outstanding question, however, remains unanswered: what sets the different EC paces observed in different organisms and tissues? This review aims to summarize the available knowledge regarding the pace of the EC, its regulation and experimental manipulation and to expose new questions that might help shed light on what is still to unveil.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

gga-miRNOME, a microRNA-sequencing dataset from chick embryonic tissues

MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules, with sizes ranging from 18 to 25 nucleotides, which are key players in gene expression regulation. These molecules play an important role in fine-tuning early vertebrate embryo development. However, there are scarce publicly available miRNA datasets from non-mammal embryos, such as the chicken (Gallus gallus), which is a classical model system to study vertebrate embryogenesis. Here, we performed microRNA-sequencing to characterize the early stages of trunk and limb development in the chick embryo. For this, we profiled three chick embryonic tissues, namely, Undetermined Presomitic Mesoderm (PSM_U), Determined Presomitic Mesoderm (PSM_D) and Forelimb Distal Cyclic Domain (DCD). We identified 926 known miRNAs, and 1,141 novel candidate miRNAs, which nearly duplicates the number of Gallus gallus entries in the miRBase database. These data will greatly benefit the avian research community, particularly by highlighting new miRNAs potentially involved in the regulation of early vertebrate embryo development, that can be prioritized for further experimental testing.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Regulating the pace of the embyo clock: RNA molecules in temporal control of vertebrate development

Durante as últimas décadas têm-se estudado com profundidade os mecanismos genéticos que levam ao correto desenvolvimento do embrião vertebrado. Estes mecanismos têm sido estudados especialmente na caraterização da expressão genética nos tecidos e de que modo a sua presença ou ausência se reflete na correta diferenciação de uma célula, no desenvolvimento de um tecido ou órgão e na correta formação do organismo. Contudo para além da localização e intensidade da expressão, uma outra dimensão muito menos explorada é o Tempo. A desregulação temporal da expressão génica pode levar a que os tecidos se diferenciem num momento ou ritmo impróprio, podendo ter consequências graves e levar mesmo à morte do organismo. Um dos processos que evidencia uma periodicidade durante o desenvolvimento, é a somitogénese. À medida que o embrião alonga ao longo do eixo antero-posterior graças à ingressão de células no botão caudal, as células da mesoderme pré-somítica (PSM) anterior formam periodicamente pares de estruturas esféricas transitórias que flanqueiam a notocorda, conhecidas como sómitos. Os sómitos diferenciam-se sendo responsáveis pela formação do esqueleto axial, bem como da musculatura esquelética e a derme das costas. A desregulação temporal da somitogénese, provoca doenças congénitas graves que afetam especialmente a formação das vertebras, como a disostose espondilocostal. Existe um relógio embrionário (EC) subjacente à periodicidade da somitogénese. O EC foi primeiramente descrito por Palmeirim e colegas (1997) no desenvolvimento do embrião de galinha. Este grupo descobriu que o gene hairy1 tem ciclos de expressão na PSM com o mesmo período que a somitogénese, 90 minutos. Posteriormente, este mecanismo foi descoberto noutros organismos e hoje em dia, sabe-se que é conservado em todos os vertebrados. O período EC é específico de cada espécie, sendo, por exemplo, 30 minutos no peixe-zebra, 120 no ratinho e entre 5 e 6 horas no Humano. Sabe-se também que vários genes pertencentes a várias vias de sinalização possuem expressão cíclica. Mais concretamente, pertencentes às vias de Notch, FGF e WNT. Dez anos depois da descoberta do EC, foi descrito que este mecanismo não era exclusivo da PSM. Pascoal e colegas (2007) descobriram que o relógio embrionário estava presente no crescimento do membro da galinha. Mais concretamente, o grupo descreveu que o gene hairy2 tem uma expressão cíclica, apresentando um período de seis horas em vez dos 90 minutos na PSM. O EC é caracterizado por mecanismos de regulação por feedback negativo em que um gene é expresso e traduzido e a proteína vai reprimir a sua própria expressão. Para além disso, o mecanismo é refinado por atrasos em diversas etapas, desde a transcrição, passando pela exportação nuclear do mRNA, pela tradução e terminando na degradação do mRNA e da proteína. Contudo, a regulação do EC, mais propriamente, como é capaz de apresentar diferentes períodos no mesmo organismo, ainda permanece por esclarecer, constituindo a questão central do presente trabalho. Neste trabalho foi explorada a hipótese da regulação da periodicidade do EC em diferentes tecidos ser exercida ao nível das moléculas de RNA. Para abordar esta hipótese, foram aplicadas diversas metodologias experimentais. Em primeiro lugar foram identificados os transcritos produzidos por hairy1 e analisado o seu impacto na segmentação do tronco embrionário (Capítulo 2). Para tal, foi feita uma sobre-expressão de ambos os transcritos identificados na PSM do embrião de galinha. Os nossos resultados indicam que a sobreexpressão do s-hairy1, tal como de hairy1, leva a um atraso no alongamento dos embriões, e a um atraso no início da somitogénese. Neste capítulo, adicionalmente, procurámos aprofundar o conhecimento acerca do relógio embrionário no membro. Estudámos a expressão de hairy1, descobrindo que também cicla com um período de 6 horas no mesênquima distal do membro. A região 3’UTR do mRNA é um dos maiores responsáveis pela regulação do tempo de meia-vida do próprio mRNA. Tendo isso em mente, estudámos os 3’UTRs de três genes centrais do relógio embrionário do peixe-zebra, her1, her7 e deltaC (dlc) (Capítulo 3). No caso de her1 e her7 deletou-se 3’UTR alternativos, contudo os resultados obtidos não revelaram um papel para os 3’UTRs alternativos no funcionamento do EC. No caso do gene dlc, dividiuse o 3’UTR em três regiões de regulação (RR), e procedeu-se à deleção dessas regiões isoladamente, ou em combinação. Quando deletadas RR1, RR2 ou a combinação das duas (RR1&2), não foram detetadas alterações significativas à expressão de dlc. Contudo, quando foram removidas RR3 ou RR2&3 obteve-se uma estabilização da expressão dos genes do EC. Uma avaliação mais aprofundada das deleções RR2 e RR3 revelou que os embriões produziam menos sómitos e mais pequenos, resultado mais notório na deleção RR3. Em ambos os casos também se verificou uma estabilização da expressão de her7. Por último, decidiu-se estudar se os miRNAs podem estar envolvidos na regulação dos períodos do EC (Capítulo 4). Para tal, analisou-se o miRNoma por sequenciação de RNA a partir de três tecidos que apresentam oscilações do EC com diferentes ritmos: PSM determinada (D-PSM), PSM indeterminada (U-PSM) e o domínio distal cíclico do membro superior (DCD). Foram identificados 926 miRNAs conhecidos. Para além disso descobrimos mais 1141 possíveis novos miRNAs em galinha (quase duplicando os que se encontram anotados na base de dados miRBase). Procedemos, posteriormente, a uma análise de expressão diferencial e à validação dos dados por RT-qPCR. Adicionalmente, os miRNAs diferencialmente expressos entre os tecidos foram comparados com os genes negativamente regulados nos mesmos tecidos e procedemos a uma análise de enriquecimento funcional GO e REACTOME. Em suma, utilizando uma nossa estratégia plural para testar a nossa hipótese, levounos a um aprofundar do conhecimentos dos mecanismos que controlam a expressão genética periódica nos tecidos onde o EC opera.Vertebrate embryo body segmentation occurs progressively over time. An embryo clock (EC) characterized by gene expression oscillations underlies somitogenesis periodicity. The EC periodicity is species-specific, i.e., 30 minutes and 90 minutes in zebrafish and chicken, respectively. The EC was also found in chicken forelimb outgrowth, however, with a 6-hour pace. Robust EC gene expression oscillations are built by negative feedback loops, which require tight regulation of mRNA stability. This thesis will present work addressing the hypothesis that alternative transcripts and/or miRNAs may account for different paces of the EC. Different approaches were followed to address this hypothesis: 1) we analyzed the alternative transcripts of the chicken EC hairy1 gene and found that both s-hairy1 and hairy1 overexpression promoted trunk developmental delay. We identified hairy1 gene expression oscillations in the limb bud with a periodicity of 6 hours. 2) Using zebrafish mutants with truncated 3’UTRs in EC mRNAs we found that deletion of the distal portion of the dlc 3’UTR stabilizes EC expression and promotes segmentation alterations. 3) We performed miRNA sequencing (miRNA-Seq) of three chicken embryo tissues: determined PSM (D-PSM), undetermined PSM (U-PSM), and forelimb distal cyclic domain (DCD). We identified 926 known miRNAs and 1141 candidate novel miRNAs not previously described in chicken. Furthermore, a differential expression analysis was conducted, and specific miRNAs were selected for validation and functional analysis. Altogether, by tackling our hypothesis in multiple mechanisms involving RNA regulation, we gave a step further in understanding the temporal control of the EC

MicroRNA processing machinery in the developing chick embryo

Uncorrected proofGene expression regulation during embryo development is under strict regulation to ensure proper gene expression in both time and space. The involvement of microRNAs (miRNA) in early vertebrate development is documented and inactivation of different proteins involved in miRNA synthesis results in severe malformations or even arrests vertebrate embryo development. However, there is very limited information on when and in what tissues the genes encoding these proteins are expressed. Herein, we report a detailed characterization of the expression patterns of DROSHA, DGCR8, XPO5 and DICER1 in the developing chick embryo, from HH1 (when the egg is laid) to HH25 (5-days incubation), using whole mount in situ hybridization and cross-section analysis. We found that these genes are co-expressed in multiple tissues, mostly after stage HH4. Before early gastrulation DICER1 expression was never detected, suggesting the operation of a Dicer-independent pathway for miRNA synthesis. Our results support an important role for miRNAs in vertebrate embryo development and provide the necessary framework to unveil additional roles for these RNA processing proteins in development.The authors thank C.J. Sheeba for lab coaching to C.S. and I. Palmeirim, S. Thorsteinsdottir and lab members for helpful discussions. G.C. and A.C.G. were supported by Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (FCT), Portugal (grants UMINHO/BI/282/2013 and UMINHO/BI/8/2014, respectively). R.P.A. was funded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2) NORTE-07-0124-FEDER

Campo abierto

Se presenta una investigación que tiene como objetivos detectar la proporción de casos de alumnos con deficiencias en la visión de los colores entre los que cursan Educación Infantil y estudiar la influencia de este tipo de deficiencias en la realización de tareas cotidianas en esta etapa de escolarización. Se incluye una introducción sobre la visión del color en la Educación Infantil y el método, los resultados y las conclusiones obtenidas gracias a esta investigación.ExtremaduraES

¿Qué es un hombre? La degradación de la persona en el Holocausto judío

El trabajo obtuvo un premio de la Modalidad B de los Premios Tomás García Verdejo a las buenas prácticas educativas en la Comunidad Autónoma de Extremadura para el curso académico 2012-2013Se describen un conjunto de actividades llevadas a cabo en el IES Francisco de Orellana (Trujillo, Cáceres) orientadas a la investigación, conocimiento y difusión del Holocausto judío, que además pretenden mejorar la convivencia dentro y fuera del entorno escolar e inculcar valores de respeto y de aceptación del otro. Las actividades se insertan en la trayectoria de enseñanza-aprendizaje de la lengua francesa y la cultura francófona de la sección bilingüe de francés del centroES