Clinical Grade Production of Wilms' Tumor-1 Loaded Cord Blood-Derived Dendritic Cells to Prevent Relapse in Pediatric AML After Cord Blood Transplantation

Hematopoietic cell transplantation (HCT) is a last resort, potentially curative treatment option for pediatric patients with refractory acute myeloid leukemia (AML). Cord blood transplantation (CBT) results in less relapses and less graft-versus-host disease when compared to other sources. Nevertheless, still more than half of the children die from relapses. We therefore designed a strategy to prevent relapses by inducing anti-AML immunity after CBT, using a CB-derived dendritic cell (CBDC) vaccine generated from CD34+ CB cells from the same graft. We here describe the optimization and validation of good manufacturing practice (GMP)-grade production of the CBDC vaccine. We show the feasibility of expanding low amounts of CD34+ cells in a closed bag system to sufficient DCs per patient for at least three rounds of vaccinations. The CBDCs showed upregulated costimulatory molecules after maturation and showed enhanced CCR7-dependent migration toward CCL19 in a trans-well migrations assay. CBDCs expressed Wilms' tumor 1 (WT1) protein after electroporation with WT1-mRNA, but were not as potent as CBDCs loaded with synthetic long peptides (peptivator). The WT1-peptivator loaded CBDCs were able to stimulate T-cells both in a mixed lymphocyte reaction as well as in an antigen-specific (autologous) setting. The autologous stimulated T-cells lysed not only the WT1+ cell line, but most importantly, also primary pediatric AML cells. Altogether, we provide a GMP-protocol of a highly mature CBDC vaccine, loaded with WT1 peptivator and able to stimulate autologous T-cells in an antigen-specific manner. Finally, these T-cells lysed primary pediatric AML demonstrating the competence of the CBDC vaccine strategy

Reprogrammation métabolique dans les leucémies aiguës myéloïdes de novo de l’adulte : impact clinique

Mémoire de Diplôme d'Etudes Spécialisées (DES) tenant lieu de thèse d'exercice.Les LAM sont un ensemble de proliférations malignes, caractérisées par l’accumulation de progéniteurs immatures dans la moelle osseuse et le sang. Leur pronostic est péjoratif, dû à la présence d’anomalies chromosomiques et moléculaires, et aux dérégulations métaboliques favorisant la prolifération des cellules leucémiques. Nous avons inclus 50 patients atteints de LAM au diagnostic, et analysé leurs profils métaboliques par RMN HRMAS. Dans une approche de métabolomique, nous avons utilisé des méthodes statistiques pour trouver des métabolites caractéristiques d’un état donné. Nous avons montré qu’il existait une diversité de profils métaboliques selon les sous-types de LAM et selon le statut moléculaire des patients. Le pronostic était fortement impacté par plusieurs métabolites, dont le 2-HG, oncométabolite produit par la mutation IDH, qui apparaît comme étant de pronostic favorable. Le lien entre le métabolisme et le statut moléculaire est fort concernant ce métabolite, car sa production intracellulaire est directement liée à la présence de la mutation IDH. A l’inverse, les dérégulations du métabolisme phospholipidique ont un impact négatif, via deux de ses métabolites principaux qui peuvent être considérés comme des marqueurs de progression tumorale et d’agressivité. Nous avons pu mettre en évidence une surexpression de glutathion et d’alanine chez certains patients chimiorésistants au traitement. Cette approche nous a permis de mieux caractériser les altérations métaboliques des patients LAM selon leur statut moléculaire, et d’établir une liste de biomarqueurs pronostiques qui pourraient être utiles lors de la prise de décision thérapeutique au diagnostic

Reprogrammation métabolique dans les leucémies aigues myéloblastiques (LAM) : Impact clinique et mécanismes oncogéniques

Cells metabolism is strongly disturbed and deregulated in cancers. Several examples reflect this phenomenon, including metabolic reprogramming described in the Warburg effect, functional deregulations of particular metabolic pathways such as the increase of the ROS production in cancer cells, or the identification of oncometabolites linked to acquired mutations such as IDH1/2 mutations, which lead to the production of a metabolite directly linked to the leukemic process in AML. In order to characterize the metabolic reprogramming associated with the leukemic process, we analyzed by an HRMAS approach the metabolites produced by different leukemic cell lines representing different subtypes of AML (different genotype and phenotype). In this model, we have shown that each type of cell line exhibited a particular metabolism in the basal state, witnessing a different metabolic signature depending on the nature of the cell line. In condition of metabolic stress (culture in a serum-free environment), all these cell lines develop mechanisms to adapt their metabolism to nutrient deficiency. Particularly, there is a common signature characterized by the overexpression of metabolites of the phospholipid pathway and of regulation of oxidative stress after 24 hours of culture in a medium without serum. Thanks to these adaptation mechanisms, the leukemic cells find after 48 hours a viability higher than 95% and a metabolic profile almost identical to normal conditions. These results show that leukemic cells develop common survival mechanisms, notably involving deregulations of lipid metabolism, which allow them to continue to proliferate in condition of metabolic stress. Other experimental conditions have been tested, in particular in glucose deficiency conditions in order to explore the path of deregulation of some amino acids such as alanine in these cell lines. Moreover, the quantitative and qualitative study of fatty acids in AMLs through a lipidomic approach reveals a similar adaptation of the lipidomic profiles of the cell lines in the same serum-free conditions previously tested. In parallel, in a study on 54 patients diagnosed with AML, we confirmed by the HRMAS approach that there were differences in metabolic profile in AML patients according to the AML subtype. We also showed that these metabolic signatures were significantly correlated with cytogenetic prognostic subgroups, response to chemotherapy treatment and patient survival. We show in particular that the metabolites overexpressed in patients with poor prognosis are found overexpressed also in patients refractory to treatment. The analysis of these metabolites shows the particular role of several metabolic pathways in the prognosis of AML: i) deregulation of the synthesis of 2-hydroxyglutarate associated with mutations in the IDH1/2 enzyme, ii) deregulation of the metabolism of phospholipids, showing an overexpression of phospholipids in adverse prognosis patients plasmas, and iii) overexpression of the synthesis of some amino acids in chemoresistant patients, suggesting an involvement of the LKB1/AMPK signaling pathway.Le métabolisme des cellules cancéreuses est fortement perturbé et dérégulé dans les cancers. Plusieurs exemples illustrent ce phénomène, notamment la reprogrammation métabolique décrite dans l’effet Warburg, les dérégulations fonctionnelles de certaines voies métaboliques telles que l’augmentation de la production de ROS dans les cellules cancéreuses, ou la mise en évidence d’oncométabolites liés à des mutations acquises telles que les mutations IDH1/2 qui entraînent la production d’un métabolite directement associé au processus leucémique dans les LAM. Afin de caractériser les reprogrammations métaboliques associées au processus leucémique, nous avons analysé par une approche HRMAS les métabolites produits par différentes lignées cellulaires leucémiques représentant différents sous types de LAM (génotype et phénotype différents). Dans ce modèle, nous avons montré que chaque type de lignée présentait un métabolisme particulier à l’état basal, témoin d’une signature métabolique différente selon la nature de la lignée. En situation de stress métabolique (culture en milieu sans sérum), toutes ces lignées développent des mécanismes d’adaptation de leur métabolisme à la carence en nutriments. En particulier, il existe une signature commune caractérisée par la surexpression de métabolites de la voie des phospholipides et de régulation du stress oxydant au bout de 24h de culture en milieu sans sérum. Grâce à ces mécanismes d’adaptation les cellules leucémiques retrouvent au bout de 48h, une viabilité supérieure à 95% et un profil métabolique quasi-identique aux conditions normales. Ces résultats montrent que les cellules leucémiques développent des mécanismes communs de survie, impliquant notamment des dérégulations du métabolisme des lipides, qui leur permettent de continuer à proliférer en situation de stress métabolique. D’autres conditions expérimentales ont été testées, notamment en condition de carence en glucose afin d’explorer la piste de la dérégulation de certains acides aminés comme l’alanine dans ces lignées. De plus, l’étude quantitative et qualitative des acides gras dans les LAM via une approche lipidomique révèle une adaptation similaire des profils lipidomiques des lignées dans les mêmes conditions de privation en sérum précédemment testées. En parallèle, dans une étude sur 54 patients au diagnostic de LAM, nous avons confirmé par l’approche HRMAS qu’il existait chez les patients LAM des différences de profil métabolique en fonction du sous-type de LAM. Nous avons également montré que ces signatures métaboliques étaient significativement corrélées aux sous-groupes pronostiques cytogénétiques, à la réponse au traitement par chimiothérapie et à la survie des patients. Nous montrons notamment que les métabolites surexprimés chez les patients de mauvais pronostic sont retrouvés surexprimés également chez les patients réfractaires au traitement. L’analyse de ces métabolites montrent le rôle particulier de plusieurs voies métaboliques dans le pronostic des LAM : i) la dérégulation de la synthèse de 2-hydroxyglutarate associée aux mutations de l’enzyme IDH1/2, ii) la dérégulation du métabolisme des phospholipides, retrouvant une surexpression de phospholipides dans les plasmas de patients de pronostic défavorable, et iii) la surexpression de la synthèse de certains acides aminés chez les patients chimiorésistants, suggérant une implication de la voie de signalisation LKB1/AMPK

Metabolic reprogramming in AML : Clinical impact and oncogenic mechanisms

Le métabolisme des cellules cancéreuses est fortement perturbé et dérégulé dans les cancers. Plusieurs exemples illustrent ce phénomène, notamment la reprogrammation métabolique décrite dans l’effet Warburg, les dérégulations fonctionnelles de certaines voies métaboliques telles que l’augmentation de la production de ROS dans les cellules cancéreuses, ou la mise en évidence d’oncométabolites liés à des mutations acquises telles que les mutations IDH1/2 qui entraînent la production d’un métabolite directement associé au processus leucémique dans les LAM. Afin de caractériser les reprogrammations métaboliques associées au processus leucémique, nous avons analysé par une approche HRMAS les métabolites produits par différentes lignées cellulaires leucémiques représentant différents sous types de LAM (génotype et phénotype différents). Dans ce modèle, nous avons montré que chaque type de lignée présentait un métabolisme particulier à l’état basal, témoin d’une signature métabolique différente selon la nature de la lignée. En situation de stress métabolique (culture en milieu sans sérum), toutes ces lignées développent des mécanismes d’adaptation de leur métabolisme à la carence en nutriments. En particulier, il existe une signature commune caractérisée par la surexpression de métabolites de la voie des phospholipides et de régulation du stress oxydant au bout de 24h de culture en milieu sans sérum. Grâce à ces mécanismes d’adaptation les cellules leucémiques retrouvent au bout de 48h, une viabilité supérieure à 95% et un profil métabolique quasi-identique aux conditions normales. Ces résultats montrent que les cellules leucémiques développent des mécanismes communs de survie, impliquant notamment des dérégulations du métabolisme des lipides, qui leur permettent de continuer à proliférer en situation de stress métabolique. D’autres conditions expérimentales ont été testées, notamment en condition de carence en glucose afin d’explorer la piste de la dérégulation de certains acides aminés comme l’alanine dans ces lignées. De plus, l’étude quantitative et qualitative des acides gras dans les LAM via une approche lipidomique révèle une adaptation similaire des profils lipidomiques des lignées dans les mêmes conditions de privation en sérum précédemment testées. En parallèle, dans une étude sur 54 patients au diagnostic de LAM, nous avons confirmé par l’approche HRMAS qu’il existait chez les patients LAM des différences de profil métabolique en fonction du sous-type de LAM. Nous avons également montré que ces signatures métaboliques étaient significativement corrélées aux sous-groupes pronostiques cytogénétiques, à la réponse au traitement par chimiothérapie et à la survie des patients. Nous montrons notamment que les métabolites surexprimés chez les patients de mauvais pronostic sont retrouvés surexprimés également chez les patients réfractaires au traitement. L’analyse de ces métabolites montrent le rôle particulier de plusieurs voies métaboliques dans le pronostic des LAM : i) la dérégulation de la synthèse de 2-hydroxyglutarate associée aux mutations de l’enzyme IDH1/2, ii) la dérégulation du métabolisme des phospholipides, retrouvant une surexpression de phospholipides dans les plasmas de patients de pronostic défavorable, et iii) la surexpression de la synthèse de certains acides aminés chez les patients chimiorésistants, suggérant une implication de la voie de signalisation LKB1/AMPK.Cells metabolism is strongly disturbed and deregulated in cancers. Several examples reflect this phenomenon, including metabolic reprogramming described in the Warburg effect, functional deregulations of particular metabolic pathways such as the increase of the ROS production in cancer cells, or the identification of oncometabolites linked to acquired mutations such as IDH1/2 mutations, which lead to the production of a metabolite directly linked to the leukemic process in AML. In order to characterize the metabolic reprogramming associated with the leukemic process, we analyzed by an HRMAS approach the metabolites produced by different leukemic cell lines representing different subtypes of AML (different genotype and phenotype). In this model, we have shown that each type of cell line exhibited a particular metabolism in the basal state, witnessing a different metabolic signature depending on the nature of the cell line. In condition of metabolic stress (culture in a serum-free environment), all these cell lines develop mechanisms to adapt their metabolism to nutrient deficiency. Particularly, there is a common signature characterized by the overexpression of metabolites of the phospholipid pathway and of regulation of oxidative stress after 24 hours of culture in a medium without serum. Thanks to these adaptation mechanisms, the leukemic cells find after 48 hours a viability higher than 95% and a metabolic profile almost identical to normal conditions. These results show that leukemic cells develop common survival mechanisms, notably involving deregulations of lipid metabolism, which allow them to continue to proliferate in condition of metabolic stress. Other experimental conditions have been tested, in particular in glucose deficiency conditions in order to explore the path of deregulation of some amino acids such as alanine in these cell lines. Moreover, the quantitative and qualitative study of fatty acids in AMLs through a lipidomic approach reveals a similar adaptation of the lipidomic profiles of the cell lines in the same serum-free conditions previously tested. In parallel, in a study on 54 patients diagnosed with AML, we confirmed by the HRMAS approach that there were differences in metabolic profile in AML patients according to the AML subtype. We also showed that these metabolic signatures were significantly correlated with cytogenetic prognostic subgroups, response to chemotherapy treatment and patient survival. We show in particular that the metabolites overexpressed in patients with poor prognosis are found overexpressed also in patients refractory to treatment. The analysis of these metabolites shows the particular role of several metabolic pathways in the prognosis of AML: i) deregulation of the synthesis of 2-hydroxyglutarate associated with mutations in the IDH1/2 enzyme, ii) deregulation of the metabolism of phospholipids, showing an overexpression of phospholipids in adverse prognosis patients plasmas, and iii) overexpression of the synthesis of some amino acids in chemoresistant patients, suggesting an involvement of the LKB1/AMPK signaling pathway

The differential activation of metabolic pathways in leukemic cells depending on their genotype and micro-environmental stress

International audienc

La reprogrammation métabolique chez les patients atteints de leucémie aigue myeloïde dépend de leur génotype et est un marqueur pronostique

International audienc

Aleukemic congenital leukemia cutis preceding monocytic leukemia with favorable outcome: A case report

Abstract A newborn girl had typical “blueberry muffin” skin lesions, which shows histopathologic features of monocytic leukemia cutis. The systemic leukemia was demonstrated after one month of life. She was treated by chemotherapy, including induction and three consolidation cures, according to the ELAM02 protocol, which led to complete remission. This case report with congenital form of AML5 cutaneous localization, preceding systemic involvement, with a 5‐year follow‐up and positive outcome is remarkable

Variation in Lipid Species Profiles among Leukemic Cells Significantly Impacts Their Sensitivity to the Drug Targeting of Lipid Metabolism and the Prognosis of AML Patients

International audienceSeveral studies have linked bad prognoses of acute myeloid leukemia (AML) to the ability of leukemic cells to reprogram their metabolism and, in particular, their lipid metabolism. In this context, we performed “in-depth” characterization of fatty acids (FAs) and lipid species in leukemic cell lines and in plasma from AML patients. We firstly showed that leukemic cell lines harbored significant differences in their lipid profiles at steady state, and that under nutrient stress, they developed common mechanisms of protection that led to variation in the same lipid species; this highlights that the remodeling of lipid species is a major and shared mechanism of adaptation to stress in leukemic cells. We also showed that sensitivity to etomoxir, which blocks fatty acid oxidation (FAO), was dependent on the initial lipid profile of cell lines, suggesting that only a particular “lipidic phenotype” is sensitive to the drug targeting of FAO. We then showed that the lipid profiles of plasma samples from AML patients were significantly correlated with the prognosis of patients. In particular, we highlighted the impact of phosphocholine and phosphatidyl-choline metabolism on patients’ survival. In conclusion, our data show that balance between lipid species is a phenotypic marker of the diversity of leukemic cells that significantly influences their proliferation and resistance to stress, and thereby, the prognosis of AML patients