Age-Dependent Association between Low Frequency of CD27/CD28 Expression on pp65 CD8+ T Cells and Cytomegalovirus Replication after Transplantation

In this cross-sectional study of 42 solid organ transplant recipients, the association of human cytomegalovirus (HCMV) replication and age with the phenotype of the HCMV-specific CD8+ T cells was analyzed by using the CMV pp65 HLA-A*0201 pentamer. A correlation between the proportion of CD28− HCMV-specific CD8+ T cells and age was observed in patients without HCMV replication (r = 0.50; P = 0.02) but not in patients with HCMV replication (r = −0.05; P = 0.83), a finding which differs from that observed for total CD8+ T cells. Within the group of patients younger than 50 years of age, patients with HCVM replication after transplantation had higher percentages of CD28− HCMV-specific CD8+ T cells (85.6 compared with 58.7% for patients without HCMV replication; P = 0.004) and CD27− HCMV-specific CD8+ T cells (90.7 compared with 68.8% for patients without HCMV replication; P = 0.03). However, in patients older than age 50 years, a high frequency of these two subpopulations was observed in patients both with and without previous HCMV replication (for CD28− HCMV-specific CD8+ T cells, 84.4 and 80.9%, respectively [P = 0.39]; for CD27− HCMV-specific CD8+ T cells 86.6 and 81.5%, respectively [P = 0.16]). In conclusion, the present study shows that in the group of recipients younger than age 50 years, HCMV replication after transplantation is associated with a high percentage of CD27− and CD28− HCMV-specific CD8+ T cells. These results suggest that the increased percentage of CD27− or CD28− HCMV-specific subsets can be considered a biomarker of HCMV replication in solid organ transplant recipients younger than age 50 years but not in older patients. Further studies are necessary to define the significance of these changes in HCMV-associated clinical complications posttransplantation

Pretransplant CMV-Specific T-Cell Immunity But Not Dose of Antithymocyte Globulin Is Associated With Recovery of Specific Immunity After Kidney Transplantation

Background This is a prospective, multicenter, observational study in cytomegalovirus (CMV)-seropositive kidney transplant recipients with pretransplant CMV-specific cell-mediated immunity (CMV-CMI) receiving antithymocyte globulin (ATG). We aimed to investigate posttransplant CMV-CMI over time and the impact of the dose-dependent ATG. Methods CMV-CMI was assessed at days +30, +45, +60, and +90 after transplantation with the QuantiFERON-CMV assay. A reactive result (interferon-γ [IFN-γ] ≥ 0.2 IU/mL) indicated a positive CMV-CMI. Results A total of 78 positive CMV-CMI patients were enrolled in the study, of which 59.5% had a positive CMV-CMI at day +30 and 82.7% at day +90. Multivariate logistic regression analysis showed that ATG dose was not associated with positive CMV-CMI at any point. However, pretransplant IFN-γ level (>12 IU/mL vs ≤12 IU/mL) was associated with positive CMV-CMI at day +30 (odds ratio, 12.9; 95% confidence interval, 3.1–53.3; P < .001). In addition, all the patients who did not recover CMV-CMI at day +90 had a pretransplant IFN-γ level ≤12 IU/mL. Conclusions More than half of CMV-seropositive kidney transplant recipients receiving ATG recover (or maintain) CMV-CMI by the first month after transplantation. The pretransplant IFN-γ level, but not the ATG dose, shows a strong association with the kinetics of this recovery

Pretransplant CMV-Specific T-Cell Immunity But Not Dose of Antithymocyte Globulin Is Associated With Recovery of Specific Immunity After Kidney Transplantation

Background: This is a prospective, multicenter, observational study in cytomegalovirus (CMV)-seropositive kidney transplant recipients with pretransplant CMV-specific cell-mediated immunity (CMV-CMI) receiving antithymocyte globulin (ATG). We aimed to investigate posttransplant CMV-CMI over time and the impact of the dose-dependent ATG. Methods: CMV-CMI was assessed at days +30, +45, +60, and +90 after transplantation with the QuantiFERON-CMV assay. A reactive result (interferon-? [IFN-?] ? 0.2 IU/mL) indicated a positive CMV-CMI. Results: A total of 78 positive CMV-CMI patients were enrolled in the study, of which 59.5% had a positive CMV-CMI at day +30 and 82.7% at day +90. Multivariate logistic regression analysis showed that ATG dose was not associated with positive CMV-CMI at any point. However, pretransplant IFN-? level (>12 IU/mL vs ?12 IU/mL) was associated with positive CMV-CMI at day +30 (odds ratio, 12.9; 95% confidence interval, 3.1-53.3; P < .001). In addition, all the patients who did not recover CMV-CMI at day +90 had a pretransplant IFN-? level ?12 IU/mL. Conclusions: More than half of CMV-seropositive kidney transplant recipients receiving ATG recover (or maintain) CMV-CMI by the first month after transplantation. The pretransplant IFN-? level, but not the ATG dose, shows a strong association with the kinetics of this recovery.This work was supported by the Fundación Progreso y Salud, Consejería de Salud y Familias, Junta de Andalucía (grant number PI-0294-2014); Spanish Ministry of Science and Innovation, Instituto de Salud Carlos III (grant number CP 18/00073 to M. F. R.); Plan Nacional de I+D+i 2013–2016 and Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (grant numbers REIPI RD16/0016/0002, RD16/0016/0003, RD16/0016/0007, RD16/0016/0008, RD16/0016/0009 and RD16/0016/0012); cofinanced by European Development Regional Fund “A way to achieve Europe,” Operative Program Intelligent Growth 2014- 2020; Spanish Network for Research in Renal Diseases (grant numbers RD16/0009/0006, RD16/0009/0008, RD16/0009/0013, RD16/0009/0014, RD16/0009/0019, RD16/0009/0034); Centro de Investigación Biomédica en Red Enfermedades Respiratorias (grant number CB06/06/0058); and Spanish Group for the Study of Infection in Transplantation and the Immunocompromised Host of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiolog

Analysis of spontaneous resolution of cytomegalovirus replication after transplantation in CMV-seropositive patients with pretransplant CD8+IFNG+ response

This prospective study evaluates whether CMV-seropositive (R+) transplant patients with pretransplant CD8+IFNG+ T-cell response to cytomegalovirus (CMV) (CD8+IFNG+ response) can spontaneously clear the CMV viral load without requiring treatment. A total of 104 transplant patients (kidney/liver) with pretransplant CD8+IFNG+ response were evaluable. This response was determined using QuantiFERON-CMV assay. The incidence of CMV replication and disease was 45.2% (47/104) and 6.7% (7/104), respectively. Of the total patients, 77.9% (81/104) did not require antiviral treatment, either because they did not have CMV replication (n = 57) or because they had asymptomatic CMV replication that could be spontaneously cleared (n = 24). Both situations are likely related to the presence of CD8+IFNG+ response to CMV, which has a key role in controlling CMV infection. However, 22.1% of the patients (23/104) received antiviral treatment, although only 7 of them did so because they had symptomatic CMV replication. These patients developed symptoms in spite of having pretransplant CD8+IFNG+ response, thus suggesting that other immunological parameters might be involved, such as a dysfunctional CD4+ response or that they might have become QFNon-reactive due to the immunosuppression. In conclusion, around 80% of R+ patients with pretransplant CD8+IFNG+ response to CMV did not require antiviral treatment, although this percentage might be underestimated. Nevertheless, other strategies such as performing an additional CD8+IFNG+ response determination at posttransplant time might provide more reliable information regarding the patients who will be able to spontaneously clear the viremia

Caracterización de un mutante de girasol (Helianthus annus L.) con alto contenido de ácido esteárico en su aceite

El trabajo ha consistido en la caracterización de un mutante de girasol con un mayor contenido de ácido esteárico que el control. El contenido de este ácido graso era cinco veces superior al de la línea control y afectaba a los principales componentes lipídicos del aceite del mutante. Los lípidos de los tejidos vegetativos (cotiledón, raíz, hipocotilo y hojas) no manifiestaban el fenotipo mutante sino que tenían un contenido de ácido esteárico similar al del control, por lo que sólo la semilla manifestaba el fenotipo alto esteárico. Se analizaron los lípidos de la semilla en varios estadios de desarrollo y se observó que ya en semillas muy jóvenes había un contenido de ácido esteárico superior al de la línea control. Por último se pretendía determinar que actividades enzimáticas estaban modificadas en el mutante. Tras realizar diversos ensayos enzimáticos, todo parecía señalar a las actividades estearil.ACP desaturasa y acil.ACP tioesterasa como las implicadas en la acumulación de ácido esteárico en el mutante de girasol. CONCLUSIONES El trabajo de esta Tesis ha consistido en la caracterización bioquímica de un mutante de girasol (Helianthus annuus L.), denominado CAS-3, con un alto contenido de ácido esteárico en su aceite, y su comparación con la línea RHA-274 utilizada como control. Como resumen del trabajo se pueden sacar las siguientes conclusiones: 1. El aceite de la semilla de la línea CAS-3 tiene un contenido de ácido esteárico entre cinco y seis veces superior al de la línea control RHA-274. Dicho aumento conlleva principalmente la disminución del contenido de ácido oleico con respecto al de RHA-274, mientras que los ácidos palmítico y linoleico se mantienen en unos niveles similares a los de la línea control. 2. El mayor contenido de ácido esteárico de las semillas CAS-3 afecta a los principales constituyentes lipídicos del aceite, triacilglicéricos y lípidos polares, aunque en estos últimos el contenido de ácido esteárico es menor que en los primeros debido a que solo poseen dos sitios de esterificación de ácidos grasos. 3. A pesar del alto contenido de ácido esteárico de la línea CAS-3, este se esterifica casi exclusivamente en las posiciones externas de los triacilglicéridos mientras que la intermedia está ocupada por ácidos grasos insaturados, al igual que en la línea control RHA-274. Esta exclusión del ácido esteárico de la posición intermedia en la línea CAS-3 confirma la especificidad de sustrato de la acil-CoA:sn-1-acilglicerol-3-P aciltransferasa. 4. El menor contenido de ácido esteárico de los lípidos polares de la semilla CAS-3 con respecto a los triacilglicéridos se explica por la exclusión de los ácidos grasos saturados de la posición sn-2 del glicerol, dejando solamente la sn-1 disponible para su esterificación. 5. La degradación de la reserva lipídica durante la germinación de la semilla es similar en la línea mutante CAS-3 que en el control RHA-274. Las pequeñas variaciones observadas no pueden atribuirse al mayor contenido de ácido esteárico de CAS-3 ya que pudiera deberse a que ambas líneas n son isogénicas. 6. Durante el desarrollo del cotiledón de la línea CAS-3 el contenido de ácido esteárico va disminuyendo aunque no llega a los niveles de la línea control, manteniéndose en un 17% frente al 4% de la línea control. 7. El contenido de ácido esteárico de los lípidos del hipocotilo de la línea CAS-3 es casi cuatro veces superior al de RHA-274 en los estadios iniciales de formación del tejido. A medida que el tejido se va desarrollando el porcentaje de ácido esteárico va disminuyendo llegando a los valores similares a los de la línea control. 8. El contenido de ácido esteárico de los lípidos de la raíz en los primeros estadios de desarrollo en la línea CAS-3 es superior al de RHA-274, aunque va disminuyendo a medida que el tejido va madurando llegando a valores similares a los de la línea de control. 9. En los lípidos de la hoja el contenido de ácido esteárico en la línea mutante CAS-3 es similar al del control tanto en hojas jóvenes como en maduras, siendo su porcentaje en ambas líneas inferior al 3% durante todo el desarrollo de la hoja. 10. Respecto a los lípidos de las flores, lígulas y granos de polen, el contenido de ácido esteárico en la línea CAS-3 se encuentra en los mismos niveles que en el control, existiendo sólo un 2% más este ácido grado en lígulas y polen. 11. Por tanto, parece ser que el fenotipo de alto esteárico de la línea CAS-3 se manifiesta solo en la semilla. Los tejidos vegetativos de una planta adulta de la línea CAS-3 tienen un porcentaje de ácido esteárico similar al de una planta de la línea control en el mismo estado de desarrollo, aunque con 2-3% más de este ácido graso. 12. El análisis de la composición de ácidos grasos de los lípidos de la semilla durante la maduración indica que las semillas más jóvenes que se pudieron recolectar, de 8 DDF, tienen ya un contenido de ácido esteárico cerca de cuatro veces superior en CAS-3 que en RHA-274. No ha sido posible determinar si existe un momento en el desarrollo de la semilla de CAS-3 a partir del cual empieza a aumentar el contenido de ácido esteárico o si ocurre desde el momento de la fecundación ya que no se pudieron recolectar semillas más jóvenes. 13. Las variaciones de la temperatura del cultivo tienen un mayor efecto sobre los niveles de ácidos grasos insaturados que sobre los saturados tanto en la línea CAS-3 como en el control, siendo el efecto más destacado el aumento del contenido de ácido linoleico al descender la temperatura de cultivo. 14. En semillas de 20 DDF, en fase activa de acumulación de lípidos, el efecto de las variaciones de la temperatura sobre el contenido de ácido esteárico de los triacilglicéridos es similar en RHA-274 y CAS-3, produciéndose un ligero aumento en el porcentaje de este ácido graso al descender la temperatura. 15. El efecto de la temperatura sobre la composición de ácidos grasos de los diferentes lípidos polares (fosfatidilinositol, fosfatidilcoilna y fosfatidiletanolamina) de semillas de 20 DDF es similar al observado en los triacilglicéridos. 16. Las semillas de 15 DDF de la línea CAS-3 exhiben una actividad acil-ACP tioesterasa relativa con una Vmax tres veces superior que la de RHA-274. 17. Las semillas de 15 DDF de la línea CAS-3 exhiben una actividad estearil-ACP desaturasa relativa tres veces inferior a la de las semillas de RHA-274, por lo que se va a producir un bloque parcial en ese punto de la ruta. 18. El hecho de que las semillas de CAS-3 de 15 DDF tengan tres veces menos actividad estearil-ACP y una actividad acil-ACP tioesterasa con una Vmax tres veces mayor que las semillas de RHA-274 parece ser la causa de que las primeras tengan un 30% de ácido esteárico en lugar del 5% de la línea control RHA-274

Clinical Factors Influencing Phenotype of HCMV-Specific CD8+ T Cells and HCMV-Induced Interferon-Gamma Production after Allogeneic Stem Cells Transplantation

Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes significant morbidity and mortality after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). In this work, we characterized the phenotype and interferon-gamma (INF-γ) production of HCMV-specific T cells using QuantiFERON-HCMV assay in 26 patients 6 months after HSCT. We analysed whether these two parameters were associated with clinical variables. Our results showed that the patients receiving stem cells from donors ≥40 years old were 12 times more likely to have HCMV-specific CD8+ T cells with “differentiated phenotype” (CD45RA+CCR7+ ≤6.7% and CD28+ ≤30%) than patients grafted from donors <40 years old (OR=12; P=0.014). In addition, a detectable IFN-γ production in response to HCMV peptides (cutoff 0.2 IU/mL IFN-γ; “reactive” QuantiFERON-HCMV test) was statistically associated with HCMV replication after transplantation (OR=11; P=0.026), recipients ≥40 versus <40 years old (OR=11; P=0.026), and the use of peripheral blood versus bone marrow as stem cell source (OR=17.5; P=0.024). In conclusion, donor age is the only factor significantly associated with the presence of the “differentiated phenotype” in HCMV-specific CD8+ T cells, whereas HCMV replication after transplantation, recipient age, and stem cell source are the factors associated with the production of IFN-γ in response to HCMV epitopes

Lack of cytomegalovirus (CMV)-specific cell-mediated immune response using QuantiFERON-CMV assay in CMV-seropositive healthy volunteers: fact not artifact.

The QuantiFERON-CMV (QF) assay measures cell-mediated immunity against cytomegalovirus (CMV-CMI), which is particularly useful in individuals susceptible to CMV infection such as transplant patients. A positive QF result identifies patients that are better protected against CMV infection. However, the significance of a negative QF result in CMV-seropositive individuals needs to be clarified. CMV-CMI was analyzed in healthy subjects using the QF assay, and, in parallel, the Flow-cytometric Assay of Specific Cell-mediated Immune response in Activated whole blood (FASCIA). FASCIA assay measures T-cell proliferation using CMV lysate as stimulus whereas QF assay use a mix of peptides. A total of 93 healthy volunteers were enrolled, and 13/71 CMV-seropositive individuals (18.3%) showed humoral/cellular discordance using QF assay (CMV+ QF-). Interestingly, with FASCIA assay CD4+ and CD8+ T-cell proliferations were lower in CMV+ QF- than in CMV+ QF+ individuals. Furthermore, CMV+ QF- volunteers had a lower level of anti-CMV IgG than CMV+ QF+ subjects. Discordant CMV+ QF- volunteers can be defined as low responder individuals since they show lower CMV-specific humoral and cellular immune responses in comparison to CMV+ QF+ individuals. Immune discordance shows the high heterogeneity of immunity to CMV in healthy subjects