Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera : Reduviidae)

Recently, we have cloned several Kazal-type serine protease inhibitors from the midgut of the Triatoma infestans bug. A single gene composed of multi Kazal-type domains, in tandem, encodes these inhibitors. in this work, we describe the purification and characterization of recombinant infestins 3-4 and 4, which are potent factor XIIa inhibitors (K-i = 67 pM and 128 pM, respectively). We also identified the first native factor XIIa inhibitor from a hematophagous insect. the factor XIIa inhibitory activity of infestin 4 demonstrates extremely efficient anticoagulant activity, prolonging activated partial thromboplastin time by approximately 3 times. Our results suggest that infestins perform a very important role in the T. infestans midgut during meal acquisition and digestion by controlling blood coagulation by means of inhibiting thrombin and factor XIIa. (C) 2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Federation of European Biochemical Societies.Universidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, BR-04044020 São Paulo, BrazilInst Butantan, Physiol Lab, BR-05504900 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, BR-04044020 São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Purification, cloning, expression and characterization of serine protease inhibitors present in Triatoma infestans, a Chagas' disease vector

Animais hematofagos possuem necessidade vital em manter o sangue de seus hospedeiros fluido, tanto na aquisicao como no armazenamento e diGestão do produto alimentar. Para tal, esses animais desenvolveram ao longo de seus processos evolutivos mecanismos para interferir na hemostasia dos seus hospedeiros. Neste trabalho foi purificado um inibidor de trombina (infestina) presente no estomago do barbeiro Triatoma infestans. A infestina apresentou massa molecular de aproximadamente 13 kDa, em SDS-PAGE, inibindo trombina e tripsina com Ki de 43 pM e 2 nM, respectivamente. A sequencia de aminoacidos da regiao N-terminal e de um peptideo interno permitiram a classificacao da infestina como um inibidor de serinoproteases da familia tipo-Kazal. Baseado em estudos anteriores e na sequencia de aminoacidos da proteina nativa, foi possivel clonar o gene da infestina. Curiosamente o gene da infestina traduziu para uma proteina composta por 4 dominios do tipo-Kazal, mas a proteina purificada correspondeu apenas aos dois primeiros dominios. Realizou-se a clonagem e expressao em leveduras S. cerevisiae do gene obtido (infestina 1-4) bem como as variantes correspondentes aos dois primeiros dominios (infestina 1-2) e aos dois ultimos (infestina 3-4). As infestinas recombinantes foram purificadas e caracterizadas, apresentando atividades inibitorias distintas. A r-infestina 1-2 apresentou atividades inibitorias similares a infestina nativa, inibindo trombina e tripsina com K de 25 pM e 3 nM, respectivamente. A r-infestina 1-4 inibiu trombina (0,8 nM), tripsina (5 nM), fator Xa (60 nM), plasmina (1 nM) e fator XIla (78 pM). A infestina 3-4 inibiu tripsina (2 nM), plasmina (0,37 nM), fator Xa(17 nM) e fator XIla (45 pM)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Structural studies of serine proteases inhibitors from the kissing bug Triatoma infestants

Animais hematófagos possuem uma necessidade vital em manter o sangue fluido, durante a aquisição, o armazenamento e digestão do alimento. Para tal, esses animais desenvolveram ao longo de seus processos evolutivos mecanismos para interferir na hemostasia dos seus hospedeiros. Foi identificado anteriormente no barbeiro Triatoma infestans vetor da doença de Chagas, um potente inibidor de trombina denominado infestina 1-2 esta proteína é codificada por um gene composto por sete domínios tipo Kazal, que possuem isoladamente diferentes atividades inibitórias para as serinoproteases plasmáticas. Esta proteína é provavelmente processada em inibidores menores compostos por 1 ou 2 domínios após a sua tradução por um mecanismo ainda desconhecido. Neste trabalho, identificou-se a presença de um potente inibidor de fator XIIa no estômago do barbeiro T. infestans correspondente aos domínios 3 e 4 do gene da infestina, confirmando a atividade inibitória sobre fator XIIa caracterizada na infestina 34 recombinante. Determinou-se ainda a estrutura tridimensional do domínio 1 de infestina em complexo com tripsina bovina a uma resolução de 2,5A. Foram analisadas as interações intramoleculares da infestina 1 responsáveis pela manutenção da estrutura do inibidor e também as interações entre as moléculas de infestina 1 e a tripsina. Adicionalmente, a infestina 4 foi clonada, expressa e a mesma apresentou características cinéticas semelhantes ao inibidor de fator XIIa nativo, inibindo não apenas fator XIIa (128 pM) mas também fator Xa (53 nM), plasmina (2,1 nM) e tripsina (11 nM). Finalmente, determinou-se a estrutura do domínio 4 da infestina a uma resolução de 1,8A ,1,73A e 1,4A. E a mesma apresentou as mesmas características estruturais de outros inibidores da família KazalBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

The full-length cDNA of anticoagulant protein infestin revealed a novel releasable Kazal domain, a neutrophil elastase inhibitor lacking anticoagulant activity

Infestins are Kazal-type serine proteinase inhibitors found in the midgut of the Chagas' disease vector, Triatoma infestans. in previous studies, we characterized two double-headed infestins with potent anticoagulant activity; infestin 1-2, which inhibits thrombin and infestin 3-4, a factor XIIa inhibitor. in the present work, we have cloned the full-length cDNA of infestins' precursor. the translated cDNA predicted a polypeptide containing a signal peptide and seven Kazal-type domains, four domains from infestin 1-2 and infestin 3-4, and three new domains. Northern blot analysis confirmed that infestins are synthesized in a single transcript (similar to 1800 bp) in the insect midgut, but not in salivary glands. Based on the cDNA sequence, the three new Kazal domains were named infestin 1R, 2R and 3R. Infestin 2R-3R has 77% amino acid sequence identity to infestin 1-2 and the same basic amino acid residue at PI position in the inhibitory reactive site suggesting that these two proteins have a similar inhibitory specificity. in contrast, infestin IR has two different characteristics when compared to the other infestins: i) a hydrophobic amino acid residue at PI position in the inhibitory reactive site and ii) a prediction to be processed as a single Kazal domain, These two characteristics were experimentally demonstrated by the purification of native infestin I R from T infestans midgut. Native infestin I R was shown to be processed as a single Kazal domain by mass spectrometry and it was able to inhibit neutrophil elastase, subtilisin A and chymotrypsin. To further characterize infestin IR inhibitory activity, it was expressed as a recombinant protein in bacteria. Recombinant infestin IR inhibited neutrophil elastase with the same K-i of the native inhibitor. Moreover, it inhibited subtilisin A, chymotrypsin and proteinase K but did inhibit neither thrombin nor coagulation assays. in conclusion, unlike the other described infestins, infestin IR did not present anticoagulant activity and is processed as a single Kazal domain with inhibitory specificity towards proteases that hydrolyze peptide bonds after hydrophobic amino acid residues. (c) 2006 Elsevier SAS. All rights reserved.Universidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, Escola Paulista Med, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, Escola Paulista Med, BR-04044020 São Paulo, BrazilWeb of Scienc