Purification, cloning, expression and characterization of serine protease inhibitors present in Triatoma infestans, a Chagas' disease vector

Abstract

Animais hematofagos possuem necessidade vital em manter o sangue de seus hospedeiros fluido, tanto na aquisicao como no armazenamento e diGestão do produto alimentar. Para tal, esses animais desenvolveram ao longo de seus processos evolutivos mecanismos para interferir na hemostasia dos seus hospedeiros. Neste trabalho foi purificado um inibidor de trombina (infestina) presente no estomago do barbeiro Triatoma infestans. A infestina apresentou massa molecular de aproximadamente 13 kDa, em SDS-PAGE, inibindo trombina e tripsina com Ki de 43 pM e 2 nM, respectivamente. A sequencia de aminoacidos da regiao N-terminal e de um peptideo interno permitiram a classificacao da infestina como um inibidor de serinoproteases da familia tipo-Kazal. Baseado em estudos anteriores e na sequencia de aminoacidos da proteina nativa, foi possivel clonar o gene da infestina. Curiosamente o gene da infestina traduziu para uma proteina composta por 4 dominios do tipo-Kazal, mas a proteina purificada correspondeu apenas aos dois primeiros dominios. Realizou-se a clonagem e expressao em leveduras S. cerevisiae do gene obtido (infestina 1-4) bem como as variantes correspondentes aos dois primeiros dominios (infestina 1-2) e aos dois ultimos (infestina 3-4). As infestinas recombinantes foram purificadas e caracterizadas, apresentando atividades inibitorias distintas. A r-infestina 1-2 apresentou atividades inibitorias similares a infestina nativa, inibindo trombina e tripsina com K de 25 pM e 3 nM, respectivamente. A r-infestina 1-4 inibiu trombina (0,8 nM), tripsina (5 nM), fator Xa (60 nM), plasmina (1 nM) e fator XIla (78 pM). A infestina 3-4 inibiu tripsina (2 nM), plasmina (0,37 nM), fator Xa(17 nM) e fator XIla (45 pM)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe