Development of analytical tools for biomarkers detection of exposure to new psychoactive substances (NPS) : in vivo, in silico, in vitro approaches

En raison de leur diffusion sauvage sur le e-commerce, leur soi-disant sécurité d’usage et l’alternative légale aux stupéfiants habituels qu’ils constituent, les nouvelles substances psychoactives (NPS) sont un phénomène mondial émergeant. Au-delà de différents défis dans nos sociétés (législation, prévention,... ), la capacité d'identifier les NPS dans des échantillons biologiques présente de nombreux challenges analytiques : ces nouvelles substances ne sont pas référencées dans les bibliothèques habituelles de spectrométrie de masse commerciales, leur métabolisme est inconnu (avec parfois des métabolites actifs), les doses actives sont parfois très faibles et par conséquent, les concentrations dans le sang ou l'urine sont également faibles. Dans ce contexte, notre laboratoire effectue régulièrement des analyses toxicologiques dans un contexte clinique, et pour les forces de l’ordre, dans des échantillons biologiques à l'aide de deux principaux types d’analyseurs : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (CL-SM/SM) pour le criblage ciblé et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CL-SMHR) pour le criblage non ciblé. Cette dernière technique est basée sur la masse exacte (mais également, le profil isotopique et le temps de rétention) des composés de l’échantillon à partir de laquelle la formule chimique est déterminée et recherchée dans une base de données spectrales en utilisant un logiciel dédié. L’objectif de ma thèse est de caractériser des NPS et leurs métabolites (afin d’alimenter cette base de données) en utilisant une stratégie combinant des approches in vitro, in silico et in vivo. Il s’agit, en particulier, d’augmenter la sensibilité de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont le plus souvent les produits majeurs d’élimination des NPS.A cet effet, une méthode in vitro destinée à produire les métabolites des NPS et utilisant des microsomes hépatiques humains a été mise en oeuvre. Les métabolites obtenus, comparés aux prédictions in silico, ont été enregistrés dans la base de données. Cette approche a été confrontée à l’analyses de comprimés et d’autres produits non biologiques contenant des NPS, mais également, à des données in vivo d’exposition aux NPS : cas d’intoxications, études expérimentales et études épidémiologiques prospectives et rétrospectives dans des populations ciblées, ou non…Au total, ce travail basé sur cette stratégie in vitro, in silico, in vivo m’a permis d’enrichir notre base de données de spectres de masse haute résolution (SMHR) pour le criblage non ciblé et également notre base de données de criblage ciblé (SM/SM). Notre méthode en haute résolution, qui s’est enrichie au cours de ces 3 années de thèse de 83 nouveaux NPS et 281 métabolites, constitue aujourd’hui un outil analytique efficient pour la détection d’une exposition aux NPS.Owing to wild e-commerce diffusion, alleging safety and legal alternative to usual drugs of abuse arguments, the new psychoactive substances (NPS) are emerging phenomenon in the world. In our societies, through various consecutive challenges (legislation, prevention, …), the ability to identify NPS in biological samples exhibits numerous analytical pitfalls: new substances which are not referenced in the usual commercial mass spectrometric libraries, unknown metabolism (with sometimes active metabolites), sometimes very low active dosages and consecutively low concentrations in blood or urine. In this context, clinical and forensic toxicological analyses in biological samples are routinely performed in our laboratory using two main analytical devices: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for targeted screening and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) for non-targeted screening. This last technique is based on the accurate mass (together with isotopic pattern and retention time) of sample components, from which the chemical formula is calculated and searched against a database of mass spectra using dedicated software. The aim of my thesis is to characterize NPS and metabolites (in order to increase the spectral database) using a strategy combining in vitro, in silico, and in vivo approaches. Therefore, the main goal is to increase the detection sensitivity of the NPS use by focusing on the metabolites that are most often the major products of NPS elimination. For this purpose, an in vitro method designed to produce NPS metabolites using human liver microsomes incubations was applied. Obtained metabolites, after confrontation with metabolites in silico predicted, were saved in database. This approach was subsequently confronted with analysis of tablets or other non-biological product containing NPS, but also, with in vivo observed data from NPS exposure: intoxication cases, experimental studies and prospective and retrospective epidemiological studies in targeted population or not … All in all, this work based on this in vitro, in silico and in vivo strategy allowed me to enhance our high resolution spectra database (HRMS) for non-targeted screening and also our spectra database for targeted screening (MS/MS). Today, our HRMS device, with a database that was increased with 83 new NPS and 281 metabolites for the duration of my thesis, is an efficient analytical tool for NPS use detection

Développement d’outils analytiques de mise en évidence de biomarqueurs d’une exposition aux nouvelles substances psychoactives (NPS) : approches in vivo, in silico, in vitro

Owing to wild e-commerce diffusion, alleging safety and legal alternative to usual drugs of abuse arguments, the new psychoactive substances (NPS) are emerging phenomenon in the world. In our societies, through various consecutive challenges (legislation, prevention, …), the ability to identify NPS in biological samples exhibits numerous analytical pitfalls: new substances which are not referenced in the usual commercial mass spectrometric libraries, unknown metabolism (with sometimes active metabolites), sometimes very low active dosages and consecutively low concentrations in blood or urine. In this context, clinical and forensic toxicological analyses in biological samples are routinely performed in our laboratory using two main analytical devices: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for targeted screening and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) for non-targeted screening. This last technique is based on the accurate mass (together with isotopic pattern and retention time) of sample components, from which the chemical formula is calculated and searched against a database of mass spectra using dedicated software. The aim of my thesis is to characterize NPS and metabolites (in order to increase the spectral database) using a strategy combining in vitro, in silico, and in vivo approaches. Therefore, the main goal is to increase the detection sensitivity of the NPS use by focusing on the metabolites that are most often the major products of NPS elimination. For this purpose, an in vitro method designed to produce NPS metabolites using human liver microsomes incubations was applied. Obtained metabolites, after confrontation with metabolites in silico predicted, were saved in database. This approach was subsequently confronted with analysis of tablets or other non-biological product containing NPS, but also, with in vivo observed data from NPS exposure: intoxication cases, experimental studies and prospective and retrospective epidemiological studies in targeted population or not … All in all, this work based on this in vitro, in silico and in vivo strategy allowed me to enhance our high resolution spectra database (HRMS) for non-targeted screening and also our spectra database for targeted screening (MS/MS). Today, our HRMS device, with a database that was increased with 83 new NPS and 281 metabolites for the duration of my thesis, is an efficient analytical tool for NPS use detection.En raison de leur diffusion sauvage sur le e-commerce, leur soi-disant sécurité d’usage et l’alternative légale aux stupéfiants habituels qu’ils constituent, les nouvelles substances psychoactives (NPS) sont un phénomène mondial émergeant. Au-delà de différents défis dans nos sociétés (législation, prévention,... ), la capacité d'identifier les NPS dans des échantillons biologiques présente de nombreux challenges analytiques : ces nouvelles substances ne sont pas référencées dans les bibliothèques habituelles de spectrométrie de masse commerciales, leur métabolisme est inconnu (avec parfois des métabolites actifs), les doses actives sont parfois très faibles et par conséquent, les concentrations dans le sang ou l'urine sont également faibles. Dans ce contexte, notre laboratoire effectue régulièrement des analyses toxicologiques dans un contexte clinique, et pour les forces de l’ordre, dans des échantillons biologiques à l'aide de deux principaux types d’analyseurs : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (CL-SM/SM) pour le criblage ciblé et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CL-SMHR) pour le criblage non ciblé. Cette dernière technique est basée sur la masse exacte (mais également, le profil isotopique et le temps de rétention) des composés de l’échantillon à partir de laquelle la formule chimique est déterminée et recherchée dans une base de données spectrales en utilisant un logiciel dédié. L’objectif de ma thèse est de caractériser des NPS et leurs métabolites (afin d’alimenter cette base de données) en utilisant une stratégie combinant des approches in vitro, in silico et in vivo. Il s’agit, en particulier, d’augmenter la sensibilité de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont le plus souvent les produits majeurs d’élimination des NPS.A cet effet, une méthode in vitro destinée à produire les métabolites des NPS et utilisant des microsomes hépatiques humains a été mise en oeuvre. Les métabolites obtenus, comparés aux prédictions in silico, ont été enregistrés dans la base de données. Cette approche a été confrontée à l’analyses de comprimés et d’autres produits non biologiques contenant des NPS, mais également, à des données in vivo d’exposition aux NPS : cas d’intoxications, études expérimentales et études épidémiologiques prospectives et rétrospectives dans des populations ciblées, ou non…Au total, ce travail basé sur cette stratégie in vitro, in silico, in vivo m’a permis d’enrichir notre base de données de spectres de masse haute résolution (SMHR) pour le criblage non ciblé et également notre base de données de criblage ciblé (SM/SM). Notre méthode en haute résolution, qui s’est enrichie au cours de ces 3 années de thèse de 83 nouveaux NPS et 281 métabolites, constitue aujourd’hui un outil analytique efficient pour la détection d’une exposition aux NPS

Analyse toxicologique avec mesure par « masse exacte ». Caractérisation de métabolites urinaires par couplage UPLC/QTOF : apports et intérêts dans le cadre de la soumission chimique

Objectifs : Le métabolisme des médicaments conduit à des composés plus polaires facilitant leur élimination dans les urines. Peu de médicaments sont retrouvés inchangés dans les urines. Souvent pour mettre en évidence une soumission chimique, le toxicologue reçoit du sang et des urines prélevés plusieurs jours voire une semaine après les faits. Plus les faits seront éloignés des prélèvements, plus les chances de mettre en évidence la moindre trace d’une substance s’amenuisent. Le but de ce travail a été de mettre en place un protocole permettant d’obtenir des informations spectrales sur des métabolites de psychotropes excrétés en grande quantité dans les urines. Méthodes : Les urines de patients ayant ingéré massivement un médicament sont analysées par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse hybride quadripôle-temps de vol (UPLC XEVO G2 QTOF). Le mode MSe réalise une double acquisition simultanée : une à basse énergie d’accélération pour obtenir la masse exacte des composés, la seconde à haute énergie d’accélération pour fragmenter l’ensemble des composés. Les données sont traitées par des logiciels spécialisés dans la recherche et la caractérisation de métabolites (MetaboLynxTM) et dans l’analyse des fragments de collision (MassFragment). Résultats : Dans les urines d’un patient ayant ingéré massivement du bromazépam, il a été possible de caractériser 3 métabolites majeurs. Lors d’une ingestion massive d’alimémazine, il a été possible de caractériser 5 métabolites majeurs. Conclusion : L’élargissement de la fenêtre de détection d’un composé dans des urines est possible par la caractérisation des métabolites

Élargissement de la fenêtre de détection du zolpidem par la recherche de ses métabolites urinaires dans le cadre de la soumission chimique

Objectif : Dans le cadre de la soumission chimique, une méthode UPLC-MS/MS a été développée pour détecter le zolpidem et ses métabolites dans les urines. Méthodes : Pour déterminer les fenêtres de détection du zolpidem et de ses métabolites dans les urines, un volontaire a pris un comprimé de 10 mg. Les urines ont ensuite été collectées 30 min et 1 h après l'administration puis toutes les 12 h pendant 144 h. Après extraction sur cartouches Oasis$^{\circledR}$ MCX (SPE), les urines ont été analysées sur une colonne ACQUITY UPLCTM BEH C18, 1,7 μm ($2,1 \times 100$ mm) avec un gradient d'acide formique 0,1 % et d'acétonitrile, la détection a été effectuée au moyen d'un spectromètre de masse en tandem en utilisant deux transitions par composé. Résultats : Le zolpidem est détecté pendant 60 h, avec un pic après 12 h. Le métabolite I (acide 4-[(3-diméthylcarboylméthyl-6-méthyl)-imidazo-[1,2a]pyridine-2-yl]-benzoïque) est détecté jusqu'au dernier temps de la cinétique, tandis que le métabolite II (acide 3-diméthylcarbamoylméthyl-2-(4-méthylphényl)-imidazo-[1,2a]-pyridine-6-carboxylique) est détecté jusque 84 h après l'administration. Conclusion : Ainsi, dans le cas de soumission chimique impliquant le zolpidem, dans les urines le métabolite I apparaît être le meilleur marqueur pour caractériser une exposition

Effect of sub-acute exposure to abamectin “insecticide” on liver rats (

Objective: Extensive use of pesticides has harmful effects; they can damage human health as well as the environment. Abamectin (ABM) has been widely employed and is one of the most commonly used pesticides in Algeria. Methods: To evaluate the toxic effects of ABM, twenty-eight male and female rats (Rattus norvegicus) were randomly assigned to four groups. Groups 1 and 3 were the male and female control groups, respectively, which received distilled water. The experimental male and female groups, 2 and 4, received 2.13 mg/animal/day of abamectin, administered orally over 28 days. The animals were maintained in the same conditions without treatment for 14 days after this period. Plasma samples at 14, 28 and 42 days were used to determine biochemical parameters and avermectin B1a residues in rat plasma. Quantities of B1a in the liver were evaluated at the end of the experiment (day 42). In this study a UHPLC–MS/MS method was used to determine B1a residues in the plasma and liver. Results: Abamectin caused an increase (p < 0.05) in the glucose count and levels of ASAT, ALAT and γ-Gt in male and female rats at 14, 28 and 42 days. All experimental animals showed the time-dependent presence of B1a residues in the plasma samples at 14 and 28 days but, after 42 days, there were no residues in the plasma of ABM-treated rats. B1a residues in the liver were detected in male and female experimental rats at the end of the experiment. Abamectin caused histopathological damage of the liver tissues in the form of dilated veins, leucocyte infiltration and degenerative hepatocytes. Conclusion: Our results show that ABM perturbs liver function in the rat