Estudo funcional da prolil oligopeptidase de Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum : nocaute gênico, inibição enzimática e processos infectivos

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018.A prolil oligopeptidase (POP) é uma serino protease que cliva peptídeos de até 30 aminoácidos, porém já foi observada sua capacidade de hidrólise de colágeno, fibronectina e componentes da matriz extracelular. Participa de importantes processos biológicos e está envolvida em diversas doenças neurológicas e inflamatórias. Estudo recentes apontaram a POP de Trypanosoma cruzi (POPTc80) como importante alvo contra a doença de Chagas por meio do desenvolvimento de vacina contra a proteína. Este trabalho teve como objetivo analisar o envolvimento da POP na patogenia de duas doenças: a doença de Chagas e a Leishmaniose visceral. A prolil oligopeptidase de T. cruzi (POPTc80) foi analisada por meio de nocaute físico do gene POPTC80 com a deleção do alelo Non-esmeraldo like pela integração do cassete contendo o gene NEO, que confere resistência a geneticina (G418), sendo observado diferenças de expressão da proteína tanto entre os diferentes clones quanto comparado a cultura selvagem. O clone B2 apresentou uma divisão celular a cada 47 h e o clone C6 a cada 52h, e a imuno marcação mostrou uma redução na intensidade do sinal de fluorescência. O nocaute do alelo Esmeraldo-like para realizar o duplo nocaute, foi com reparo por homologia direta (RHD) e inserção do cassete que confere resistência a marca de seleção higromicina. O duplo nocaute (poptc80-/-) foi confirmado pela amplificação do gene higromicina fosfotransferase e corroborado pela imunofluorescência (IF) com ausência de marcação da POPTc80 nos parasitos. A POP de L. infantum (POPLi) foi avaliada quanto a sua capacidade infectiva em macrófagos murinos sob presença de inibidores específicos da POP, S 17092 e Z-Pro-Prolinal, indicando 50% de redução da taxa de infecção, o que também foi observado quando os parasitos foram incubados com a proteína recombinante e o anticorpo. A POPLi foi observada expressa na fração de membrana e citoplasmática do parasito e este resultado foi corroborado pelo ensaio de IF. A análise funcional da POP de T. cruzi e L. infantum, nos permite avançar na busca por novos alvos quimioterápicos para o tratamento de ambas as doenças tropicais negligenciadas.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Prolyl oligopeptidase (POP) is a serine protease that cleaves peptides of up to 30 amino acids, but its ability to hydrolyze collagen, fibronectin and extracellular matrix components has already been observed. It participates in important biological processes and is involved in several neurological and inflammatory diseases. Recent studies have pointed to POP of Trypanosoma cruzi (POPTc80) as an important target against Chagas' disease through the development of a vaccine against the protein. This work aimed to analyze the involvement of POP in the pathogenesis of two diseases: Chagas disease and visceral leishmaniasis. The T. cruzi prolyl oligopeptidase (POPTc80) was analyzed by physical knockout of the POPTC80 gene with the deletion of the Non-Esmerald allele allele by the integration of the NEO gene-containing cassette that confers resistance to geneticin (G418), with differences expression of the protein both among the different clones and compared to the wild type. Clone B2 showed a cell division every 47 h and clone C6 every 52 h, and immunoblotting showed a reduction in fluorescence signal intensity. The knockout of the Esmeraldo-like allele to perform the double knockout was with direct homology repair (RHD) and insertion of the cassette that confers resistance to the hygromycin selection marker. The double knockout (poptc80 - / -) was confirmed by amplification of the hygromycin phosphotransferase gene and corroborated by immunofluorescence (IF) with no labeling of POPTc80 in the parasites. The POP of L. infantum (POPLi) was evaluated for its infective capacity in murine macrophages in the presence of specific inhibitors of POP, S 17092 and Z-Pro-Prolinal, indicating a 50% reduction in infection rate, which was also observed when the parasites were incubated with the recombinant protein and the antibody. POPLi was observed expressed in the membrane and cytoplasmic fraction of the parasite and this result was corroborated by the IF assay. The functional analysis of the POP of T. cruzi and L. infantum allows us to advance in the search for new chemotherapeutic targets for the treatment of both neglected tropical diseases

Caracterização bioquímica da Prolil Oligopeptidase de Leishmania chagasi, um potencial alvo quimioterápico para as Leishmanioses

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, Laboratório de Interação Parasito-Hospedeiro, 2014.As leishmanioses representam um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e é endêmica em 98 países atingindo mais de 12 milhões de pessoas no mundo. O tratamento disponível para esta doença pode levar a sérios efeitos colaterais e, por se tratar de uma doença negligenciada, os incentivos para o desenvolvimento de novos medicamentos são insuficientes. Este cenário revela a necessidade de estudar a biologia do parasito focalizando na busca de fatores de virulência como alvos potenciais para novos fármacos. As proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, bem como na patogenia de doenças infecciosas e crônicas. Neste contexto, este trabalho de mestrado se concentrou nos estudos iniciais da prolil oligopeptidase de Leishmania chagasi, uma serino protease, por meio da sua caracterização bioquímica. Primeiramente, para expressar a proteína recombinante, o gene POPLc foi clonado no vetor pET15b e a proteína foi expressa em E. coli BL21-AI sob indução com 0,5 mM de IPTG e 0,2% de L-arabinose a 20 °C por 4 h. A rPOPLc foi expressa de forma solúvel e foi purificada por afinidade da sua cauda de 6 x His em coluna de Ni- Agarose. A partir da enzima purificada foram realizados testes cinéticos, onde a melhor atividade foi encontrada em tampão HEPES 25 mM, DTT 5 mM e NaCl 150 mM, pH 7,5, sendo estabelecido como o tampão ótimo para a atividade enzimática. A enzima apresentou Km de 58,56744 e Vmáx de 4.651,16 mFU/min a partir da hidrólise de Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC, substrato que apresentou maior atividade dentre todos testados neste estudo. A rPOPLc foi inibida por TLCK e TPCK, mas não por ABESF, um inibidor de serino protease. Além do mais, a rPOPLc foi inibida por Z-Pro-Prolinal, um inibidor específico de POPs, com IC50 de 5,2 nM. De acordo com a imunocitolocalização, foi observado que a rPOPLc está presente na região citoplasmática do parasito. Este trabalho permitiu realizar uma primeira caracterização da POP de Leishmania chagasi e o entendimento do seu papel na biologia do parasito poderá contribuir para a busca de novos medicamentos alternativos para as leishmanioses. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTLeishmaniasis represents a group of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania and is endemic in 98 countries reaching more than 12 million people worldwide. The available treatment for this disease can lead to serious side effects and, since it is a neglected disease, the incentives for the development of new drugs are insufficient. This scenario shows the need to study the biology of the parasite focusing on the search for virulence factors as potential targets for new drugs. Proteases are enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds and are involved in many physiological processes, as well as in the pathogenesis of infectious and chronic diseases. In this context, this work focused on the initial studies of Leishmania chagasi prolyl oligopeptidase a serine protease, through its biochemical characterization. First, to express the recombinant protein, POPLc gene was cloned into pET15b vector and the protein was expressed in Escherichia coli BL21 -AI upon induction with 0.5 mM IPTG and 0.2 % L- arabinose at 20 ° C for 4 h. The rPOPLc was expressed soluble and purified by affinity chromatography in Ni - Agarose column. The kinetic tests show thatPOPLc the best activity was found in HEPES 25 mM, DTT 5 mM and NaCl 150 mM, pH 7.5, buffer set as the optimum one for all enzyme activity test. N-Suc - Gly - Pro - Leu - Gly - Pro - AMC substrate showed the highest activity among all tested in this study and rPOPLc presented a Km and Vmx values of 58,56744 and 4.651,16 mFU/min, respectively, using this substrate. The rPOPLc was inhibited by TPCK and TLCK, although it was insensible to AEBSF. Furthermore, the rPOPLc was inhibited by Z- Pro- prolinal, a specific inhibitor of POPs with IC50 of 5.2 nM. According to immunocitolocalization, it was observed that rPOPLc is present in the cytoplasmic region of the parasite. This work allowed for an initial characterization of Leishmania chagasi POP and the understanding of POPLc role in the biology of the parasite may contribute to the search of new alternative drugs for leishmaniasis

Essential oils : in vitro activity against Leishmania amazonensis, cytotoxicity and chemical composition

Background: The current chemotherapy for cutaneous leishmaniosis (CL) has a series of drug limitations such as toxic side effects, long duration, high costs and drug resistance, which requires the development of new drugs or effective alternatives to the CL treatment. Essential oils (EOs) are complex mixtures of secondary metabolites from various plants. It has been shown that several EOs, or their constituents, have inhibitory activity against protozoa. Thus, this study aims to evaluate the biological activity of different essential oils (EOs) on Leishmania (L.) amazonensis promastigotes forms, as well as their cytotoxicity on mammalian cells and chemical composition. Methods: Sixteen EOs were evaluated by mean of IC50/24 h and cytotoxicity against L6 cells (CC50/24 h) using Resazurin assay. Only those EOs that presented better results for IC50/24 h were submitted to GC–MS analysis to determine their chemical constitution. Results: The EO from Cinnamodendron dinisii, Matricaria chamomilla, Myroxylon peruiferum, Salvia sclarea, Bulnesia sarmientoi, Ferula galbaniflua, Siparuna guianensis and Melissa officinalis were the most active against L. amazonensis with IC50/24 h ranging from 54.05 to 162.25 μg/mL. Analysis of EOs by GC–MS showed mainly the presence of β-farnesene (52.73 %) and bisabolol oxide (12.09 %) for M. chamomilla; α-copaene (13.41 %), safrole (8.35 %) and δ-cadinene (7.08 %) for M. peruiferum; linalool (28.80 %) and linalyl acetate (60.08 %) for S. sclarea; guaiol (48.29 %) and 2-undecanone (19.49 %) for B. sarmientoi; ethyl phthalate (13.09 %) and methyl-8-pimaren-18-oate (41.82 %) for F. galbaniflua; and neral (37.18 %) and citral (5.02 %) for M. officinalis. Conclusion: The EO from F. galbaniflua showed to be effective against L. amazonensis promastigotes forms and presented low cytotoxic activity against L6 cells. Thus, it represents a strong candidate for future studies aiming its molecular activity on these pathogenic parasites

Robust estimation of bacterial cell count from optical density

Optical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressing E. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals <1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data

Análise das carências estruturais para o ensino de ciências em escolas de Taguatinga - DF

Monografia (graduação)—Universidade de Brasília, Curso de Licenciatura em Biologia a Distância, 2011.Este trabalho irá abordar os principais problemas encontrados nas escolas públicas de Taguatinga – DF e as conseqüências que a falta de estrutura para o ensino de ciências traz para a educação e para a formação dos jovens. Os resultados aqui apresentados nos mostram que os alunos sentem a necessidade de terem aulas mais dinâmicas e que o uso de laboratórios é de fundamental importância para a fixação de conteúdos no ensino de biologia

Liposomes Composed by Membrane Lipid Extracts from Macrophage Cell Line as a Delivery of the Trypanocidal N,N’-Squaramide 17 towards Trypanosoma cruzi

Chagas is a neglected tropical disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects about 25 million people worldwide. N, N’-Squaramide 17 (S) is a trypanocidal compound with relevant in vivo effectiveness. Here, we produced, characterized, and evaluated cytotoxic and trypanocidal effects of macrophage-mimetic liposomes from lipids extracted of RAW 264.7 cells to release S. As results, the average hydrodynamic diameter and Zeta potential of mimetic lipid membranes containing S (MLS) was 196.5 ± 11 nm and −61.43 ± 2.3 mV, respectively. Drug entrapment efficiency was 73.35% ± 2.05%. After a 72 h treatment, MLS was observed to be active against epimastigotes in vitro (IC50 = 15.85 ± 4.82 μM) and intracellular amastigotes (IC50 = 24.92 ± 4.80 μM). Also, it induced low cytotoxicity with CC50 of 1199.50 ± 1.22 μM towards VERO cells and of 1973.97 ± 5.98 μM in RAW 264.7. MLS also induced fissures in parasite membrane with a diameter of approximately 200 nm in epimastigotes. MLS showed low cytotoxicity in mammalian cells and high trypanocidal activity revealing this nanostructure a promising candidate for the development of Chagas disease treatment