Generation and characterisation of monoclonal antibodies against cell cycle and cytokinesis regulators in Trypanosoma brucei

Trypanosoma brucei é o parasita que causa Trypanossomose Africana, sendo transmitido pela picada de um inseto vetor para a corrente sanguínea do hospedeiro mamífero. Afeta atualmente 36 países sub-saharianos e a falta de métodos de diagnóstico eficazes e de tratamentos seguros e eficazes, levou à necessidade de se desenvolverem novas medidas de controlo e novas estratégias terapêuticas. O ciclo celular do parasita T. brucei é invulgar. Uma vez que é tão distinto do ciclo celular dos mamíferos, as proteínas que o regulam têm sido consideradas como possíveis alvos terapêuticos. No entanto, muitas proteínas reguladoras ainda não foram identificadas e a função específica de algumas proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular é desconhecida. De entre os diversos reguladores do ciclo celular, estão as CRKs e as ciclinas que as ativam. Em T. brucei, foram identificadas 11 CRKs (CRK1-4 and CRK6-12) e 10 ciclinas. No entanto, ainda nem todas têm uma função conhecida e apenas dois complexos CRK:ciclina foram identificados in vivo. Durante este projeto, provou-se a existência de um novo complexo: CRK12:CYC9, que interage in vivo tanto na forma sanguínea como na forma procíclica. Um resultado interessante é que, apesar de interagirem, cada proteína regula diferentes processos biológicos na forma sanguínea do parasita. Na realidade, enquanto a CYC9 está envolvida na regulação do ciclo celular, levando a um bloqueio da citocinese em células em que não é expressa, a cinase CRK12 assume um papel essencial na regulação da endocitose. Esta consiste na primeira vez que uma CRK foi relacionada com o processo de endocitose de T. brucei, levando na sua ausência a um alargamento da bolsa flagelar. De forma a garantir estas diferentes funções, tanto a cinase CRK12 como a ciclina 9 podem interagir com outras proteínas, ou ser substituídas funcionalmente por outras cinases/ciclinas. O uso de anticorpos monoclonais e ensaios de proteção têm sido estudados frequentemente como alternativas terapêuticas. Com esse objetivo, anticorpos monoclonais foram produzidos contra CRK12. Apesar de se ter produzido um anticorpo que reconhece especificamente esta cinase em diferentes extratos celulares de T. brucei, não foi possível usar o mesmo em estudos de localisação por fluorescência e os ensaios de neutralização/proteção não foram feitos devido a limitações de tempo. Um projeto alternativo desenvolvido tinha como objetivo identificar possíveis proteínas reguladoras. Como tal, extratos de citoesqueleto foram obtidos em células sincronizadas em mitose e citocinese, e usados para geração de anticorpos monoclonais. Um total de 28 anticorpos foram selecionados. Apesar de não mostrarem especificidade contra uma fase específica do ciclo celular, produziram-se anticorpos com imunolocalisações muito interessantes. Além disso, estes anticorpos poderiam num futuro ser usados como ferramentas valiosas para estudar diferentes processos biológicas em T. brucei.Trypanosomabruceiis the causative agent of African Trypanosomiasis, being transmitted by the bite of a blood-feeding invertebrate vector into the mammalian host. It affects 36 sub-Saharan African countries and the lack of efficient diagnostic methods and safe and effective drugs has led to the need fornew control measures and novel treatment strategies. Cell cycle progression in T. bruceiis quite unique. Being so distinct from the mammalian cell cycle, regulatory proteins are believed to constitute good drug targets. However, many of these proteinsremain to be identified, and their rolesin specific pathwaysarestill unknown. The cdc-2 related kinases (CRKs) and their cyclin partners are among the different cell cycle regulators that are vital for an accurate progression through the cell cycle. InT. brucei, several CRKs (CRK1-4 and CRK6-12) and cyclins (CYC2-11) have been identified, although a role in cell cycle regulation has not been established for all of them and only two active CRK:cyclin complexes have been identified in vivo. During this project, CRK12 and CYC9 have been proved to constitute a novel CRK:cyclin complex in vivo, in both the bloodstream (BSF) and the procyclic (PCF) stages. Interestingly, each protein regulates different biological processes in BSF trypanosomes. In fact, whileCYC9 is involved in cell cycle regulation, blocking cytokinesis once depleted, CRK12 has a critical role in the endocytic pathway. It is the first time a CRK is connected with regulation of endocytosis, causing enlargement of the flagellar pocket if depleted. The interaction of CRK12 and CYC9 with additional proteins and the presence of functional redundancy between kinases/cyclins might explain the different functions. The use of monoclonal antibodies (MAbs) and immunisation strategies as therapeutic techniques hasbeen the subject of several studies. With that aim, α-CRK12 MAbs were efficiently generated, recognising the protein specifically in different T. bruceicell extracts. However, this MAb might not be suitable for immunolocalisation studies. Time constraints did not allow neutralization/protection studies. A parallel approach was taken to identify new proteins as cell cycle regulators. BSF cultures were synchronized in S-phase by addition of hydroxyurea, and cytoskeleton extracts of populations enriched forcells in mitosis and cytokinesis were used for MAb generation. After different screening techniques, a total of 28 MAbs were selected and the proteins they recognised, their cell cycle specificity and immunolocalisation of the recognised antigensanalysed. Although a specific antigen was not identified as a possible mitosis/cytokinesis regulator, interesting MAbs were generated with respect toto their localisation in the T. bruceicytoskeleton. Additionally, these MAbs couldbecome valuable tools to understand cellular biology and different biological pathways in T. brucei

Livro Verde dos Montados

O Livro Verde dos Montados apresenta diversos objectivos que se interligam: Em primeiro lugar, o Livro Verde pretende reunir e sistematizar, de uma forma simples e acessível ao público, o conhecimento produzido em Portugal pelos investigadores e técnicos de várias instituições de investigação ou de gestão que estudam o Montado. Assume-se como uma oportunidade de caracterizar o sistema tendo em conta as suas várias dimensões, identificando as principais ameaças à sua preservação assim como os caminhos que podem ajudar à sua sustentabilidade. Não sendo um documento científico, baseia-se no conhecimento científico e pretende constituir a base para uma plataforma de organização, tanto dos investigadores como do conhecimento científico actualmente produzido em Portugal sobre o Montado.Em segundo lugar, o Livro Verde deverá contribuir para um entendimento partilhado do que é o Montado, por parte do público, de técnicos e de especialistas, conduzindo a uma classificação mais clara do que pode ser considerado Montado e de quais os tipos distintos de Montados que podem ser identificados. Em terceiro lugar, o Livro Verde estabelece as bases para uma estratégia coordenada de disponibilização de informação sobre o sistema Montado, visando o seu conhecimento, apreciação e valorização pela sociedade portuguesa no seu conjunto. Deste modo, o Livro Verde poderá constituir um instrumento congregador e inspirador para a realização de acções de sensibilização e informação sobre o Montado. Em quarto lugar, pretende-se que o Livro Verde contribua para um maior reconhecimento e valorização do Montado como sistema, a nível do desenho das políticas nacionais por parte dos vários sectores envolvidos.Finalmente, o Livro Verde constituirá um documento parceiro do Livro Verde das Dehesas, produzido em Espanha em 2010, de forma a reforçar o reconhecimento e a devida valorização destes sistemas silvo-pastoris no desenho das estratégias e políticas relevantes pelas instituições europeias. Em suma, os autores pretendem que o Livro Verde dos Montados se afirme como o primeiro passo para uma efectiva definição e implementação de uma estratégia nacional para os Montados

Studies of the mass composition of cosmic rays and proton-proton interaction cross-sections at ultra-high energies with the Pierre Auger Observatory

In this work, we present an estimate of the cosmic-ray mass composition from the distributions of the depth of the shower maximum (Xmax) measured by the fluorescence detector of the Pierre Auger Observatory. We discuss the sensitivity of the mass composition measurements to the uncertainties in the properties of the hadronic interactions, particularly in the predictions of the particle interaction cross-sections. For this purpose, we adjust the fractions of cosmic-ray mass groups to fit the data with Xmax distributions from air shower simulations. We modify the proton-proton cross-sections at ultra-high energies, and the corresponding air shower simulations with rescaled nucleus-air cross-sections are obtained via Glauber theory. We compare the energy-dependent composition of ultra-high-energy cosmic rays obtained for the different extrapolations of the proton-proton cross-sections from low-energy accelerator data

Study of downward Terrestrial Gamma-ray Flashes with the surface detector of the Pierre Auger Observatory

The surface detector (SD) of the Pierre Auger Observatory, consisting of 1660 water-Cherenkov detectors (WCDs), covers 3000 km2 in the Argentinian pampa. Thanks to the high efficiency of WCDs in detecting gamma rays, it represents a unique instrument for studying downward Terrestrial Gamma-ray Flashes (TGFs) over a large area. Peculiar events, likely related to downward TGFs, were detected at the Auger Observatory. Their experimental signature and time evolution are very different from those of a shower produced by an ultrahigh-energy cosmic ray. They happen in coincidence with low thunderclouds and lightning, and their large deposited energy at the ground is compatible with that of a standard downward TGF with the source a few kilometers above the ground. A new trigger algorithm to increase the TGF-like event statistics was installed in the whole array. The study of the performance of the new trigger system during the lightning season is ongoing and will provide a handle to develop improved algorithms to implement in the Auger upgraded electronic boards. The available data sample, even if small, can give important clues about the TGF production models, in particular, the shape of WCD signals. Moreover, the SD allows us to observe more than one point in the TGF beam, providing information on the emission angle

Radio Interferometry applied to air showers recorded by the Auger Engineering Radio Array

A new radio interferometric technique was recently developed that takes into account time lags caused by the three-dimensional dependency of the refractive index in the atmosphere. It enables us to track the extensive air shower while it propagates through the atmosphere. Using this technique, properties of the air shower can be estimated, like the depth of maximum and the axis of propagation. In order to apply this method, strict constraints on the time-synchronisation between radio antennas in an array must be satisfied. In this contribution, we show that the Auger Engineering Radio Array can meet these timing criteria by operating a time reference beacon. We will show how this enables us to reconstruct air shower properties using the radio interferometric technique

Investigating multiple elves and halos above strong lightning with the fluorescence detectors of the Pierre Auger Observatory

ELVES are being studied since 2013 with the twenty-four FD Telescopes of the Pierre Auger Observatory, in the province of Mendoza (Argentina), the world’s largest facility for the study of ultra-high energy cosmic rays. This study exploits a dedicated trigger and extended readout. Since December 2020, this trigger has been extended to the three High levation Auger Telescopes (HEAT), which observe the night sky at elevation angles between 30 and 60 degrees, allowing a study of ELVES from closer lightning. The high time resolution of the Auger telescopes allows us to upgrade reconstruction algorithms and to do detailed studies on multiple ELVES. The origin of multiple elves can be studied by analyzing the time difference and the amplitude ratio between flashes and comparing them with the properties of radio signals detected by the ENTLN lightning network since 2018. A fraction of multi-ELVES can also be interpreted as halos following ELVES. Halos are disc-shaped light transients emitted at 70-80 km altitudes, appearing at the center of the ELVES rings, due to the rearrangement of electric charges at the base of the ionosphere after a strong lightning event