Trypanosoma brucei é o parasita que causa Trypanossomose Africana, sendo transmitido pela picada de um inseto vetor para a corrente sanguínea do hospedeiro mamífero. Afeta atualmente 36 países sub-saharianos e a falta de métodos de diagnóstico eficazes e de tratamentos seguros e eficazes, levou à necessidade de se desenvolverem novas medidas de controlo e novas estratégias terapêuticas.
O ciclo celular do parasita T. brucei é invulgar. Uma vez que é tão distinto do ciclo celular dos mamíferos, as proteínas que o regulam têm sido consideradas como possíveis alvos terapêuticos. No entanto, muitas proteínas reguladoras ainda não foram identificadas e a função específica de algumas proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular é desconhecida. De entre os diversos reguladores do ciclo celular, estão as CRKs e as ciclinas que as ativam. Em T. brucei, foram identificadas 11 CRKs (CRK1-4 and CRK6-12) e 10 ciclinas. No entanto, ainda nem todas têm uma função conhecida e apenas dois complexos CRK:ciclina foram identificados in vivo. Durante este projeto, provou-se a existência de um novo complexo: CRK12:CYC9, que interage in vivo tanto na forma sanguínea como na forma procíclica. Um resultado interessante é que, apesar de interagirem, cada proteína regula diferentes processos biológicos na forma sanguínea do parasita. Na realidade, enquanto a CYC9 está envolvida na regulação do ciclo celular, levando a um bloqueio da citocinese em células em que não é expressa, a cinase CRK12 assume um papel essencial na regulação da endocitose. Esta consiste na primeira vez que uma CRK foi relacionada com o processo de endocitose de T. brucei, levando na sua ausência a um alargamento da bolsa flagelar. De forma a garantir estas diferentes funções, tanto a cinase CRK12 como a ciclina 9 podem interagir com outras proteínas, ou ser substituídas funcionalmente por outras cinases/ciclinas.
O uso de anticorpos monoclonais e ensaios de proteção têm sido estudados frequentemente como alternativas terapêuticas. Com esse objetivo, anticorpos monoclonais foram produzidos contra CRK12. Apesar de se ter produzido um anticorpo que reconhece especificamente esta cinase em diferentes extratos celulares de T. brucei, não foi possível usar o mesmo em estudos de localisação por fluorescência e os ensaios de neutralização/proteção não foram feitos devido a limitações de tempo.
Um projeto alternativo desenvolvido tinha como objetivo identificar possíveis proteínas reguladoras. Como tal, extratos de citoesqueleto foram obtidos em células sincronizadas em mitose e citocinese, e usados para geração de anticorpos monoclonais. Um total de 28 anticorpos foram selecionados. Apesar de não mostrarem especificidade contra uma fase específica do ciclo celular, produziram-se anticorpos com imunolocalisações muito interessantes. Além disso, estes anticorpos poderiam num futuro ser usados como ferramentas valiosas para estudar diferentes processos biológicas em T. brucei.Trypanosomabruceiis the causative agent of African Trypanosomiasis, being transmitted by the bite of a blood-feeding invertebrate vector into the mammalian host. It affects 36 sub-Saharan African countries and the lack of efficient diagnostic methods and safe and effective drugs has led to the need fornew control measures and novel treatment strategies. Cell cycle progression in T. bruceiis quite unique. Being so distinct from the mammalian cell cycle, regulatory proteins are believed to constitute good drug targets. However, many of these proteinsremain to be identified, and their rolesin specific pathwaysarestill unknown. The cdc-2 related kinases (CRKs) and their cyclin partners are among the different cell cycle regulators that are vital for an accurate progression through the cell cycle. InT. brucei, several CRKs (CRK1-4 and CRK6-12) and cyclins (CYC2-11) have been identified, although a role in cell cycle regulation has not been established for all of them and only two active CRK:cyclin complexes have been identified in vivo. During this project, CRK12 and CYC9 have been proved to constitute a novel CRK:cyclin complex in vivo, in both the bloodstream (BSF) and the procyclic (PCF) stages. Interestingly, each protein regulates different biological processes in BSF trypanosomes. In fact, whileCYC9 is involved in cell cycle regulation, blocking cytokinesis once depleted, CRK12 has a critical role in the endocytic pathway. It is the first time a CRK is connected with regulation of endocytosis, causing enlargement of the flagellar pocket if depleted. The interaction of CRK12 and CYC9 with additional proteins and the presence of functional redundancy between kinases/cyclins might explain the different functions. The use of monoclonal antibodies (MAbs) and immunisation strategies as therapeutic techniques hasbeen the subject of several studies. With that aim, α-CRK12 MAbs were efficiently generated, recognising the protein specifically in different T. bruceicell extracts. However, this MAb might not be suitable for immunolocalisation studies. Time constraints did not allow neutralization/protection studies. A parallel approach was taken to identify new proteins as cell cycle regulators. BSF cultures were synchronized in S-phase by addition of hydroxyurea, and cytoskeleton extracts of populations enriched forcells in mitosis and cytokinesis were used for MAb generation. After different screening techniques, a total of 28 MAbs were selected and the proteins they recognised, their cell cycle specificity and immunolocalisation of the recognised antigensanalysed. Although a specific antigen was not identified as a possible mitosis/cytokinesis regulator, interesting MAbs were generated with respect toto their localisation in the T. bruceicytoskeleton. Additionally, these MAbs couldbecome valuable tools to understand cellular biology and different biological pathways in T. brucei
