Synthèse d'analogues cycliques de nucléotides (PNA) ciblant des boucles de l'ARN du VIH-1

Les médicaments utilisés dans la thérapie antirétrovirale hautement active pour traiter l'infection au VIH sont à l'heure actuelle orientés contre deux enzymes, la transcriptase inverse et la protéase. Ces drogues ont permis la réduction de la mortalité, mais les traitements sont contraignants et coûteux. De plus, l'apparition d'effets secondaires et de souches virales résistantes conduisent à l'échappement thérapeutique. L'adaptation de la polythérapie aux échappements viraux nécessite la découverte de nouvelles molécules ayant des cibles différentes. Les ARN sont impliqués dans de nombreux processus essentiels au niveau cellulaire impliquant des structures particulières d'ARN comme les tige-boucles. Dans ce cas, les interactions ARN-ARN procèdent par des reconnaissances "boucle-boucle" spécifiques qui conduisent à des complexes relativement stables. Au niveau de l'ARN génomique du VIH-1, il existe un certain nombre de tige-boucles impliquées dans de nombreuses étapes du cycle viral. Dans le but d'interagir, et donc de perturber les fonctions de deux de ces structures en tige-boucle, l'ARN TAR et le site ?, nous avons développé des molécules antisens, analogues nucléotidiques, courts et cycliques, complémentaires de ces boucles. Ces analogues cycliques sont constitués par l'enchaînement de six à huit PNA (" Peptide ou Polyamide Nucleic Acids "). Les PNA possèdent des propriétés d'hybridation remarquables avec les acides nucléiques, supérieures aux autres analogues. Ils sont donc particulièrement intéressants dans le cadre d'une stratégie antisens. Dans ce manuscrit, nous décrivons la synthèse en phase liquide de six PNA courts cycliques ou non par différentes stratégies. L'évaluation biologique de quatre de ces composés est également proposée.The active drugs used by antiviral therapy to treat the HIV infection are directed against two enzymes: the reverse transcriptase and the protease. Although these treatments allow to reduce mortality, they are restrictive and expensive. Moreover, they are associated with many side effects and with the emergence of resistant viral strains which explain the therapeutic release. Thus, the devise of new molecules targeting other viral replication steps seems to be necessary. Specific tertiary RNA elements, in particular "stem-loop" structures, are implicated in various essential cellular processes. In these cases, the RNA-RNA recognition occurs via a specific "loop-loop" interaction to give stable "kissing loop" complexes. Several "stem-loop" structures of the HIV-1 genome are involved in different steps of the replication cycle. With the aim of interacting to disrupt the functions of two of these "stem-loop" structures: TAR-RNA and Y site, we have elaborated short cyclic nucleotide analogs, complementary to their loops. These analogs are constituted by six to eight PNA residues (Peptide or Polyamide Nucleic Acids), which hybridize remarkably to nucleic acids with a higher stability than other analogs. In this manuscript, we discuss the synthesis of several PNA (cyclic or linear) by different liquid-phase strategies. Biological evaluation of four of these compounds is also reported.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Synthèse de peptides et de PNAs dirigés contre les ARN du VHC et du VIH-1 (activité antivirale et pénétration cellulaire)

Les antiviraux actuels, dirigés contre les enzymes virales du VHC et du VIH, conduisent à l émergence rapide de souches résistantes. Une approche intéressante pour contourner ce problème consiste à cibler des fragments d ARN non traduits. De façon générale, deux approches sont envisagées pour cibler des fragments d ARN : l inhibition par des petites molécules et l approche antisens. Dans le cadre de la recherche de petites molécules dirigées contre les deux boucles E des domaines IIb et IIId de l IRES du VHC, nous avons synthétisé 52 peptides et dérivés de peptides linéaires et cycliques contenant la séquence d acides aminés Lys-Lys-Pro-Lys. En parallèle, nous avons tenté d améliorer la pénétration cellulaire d oligonucléotides antisens de type PNA. Ainsi, nous avons synthétisé deux synthons contenant un groupement fluorescent et une cystéine liée au cation lipophile 4-thiobutyltriphénylphosphonium (TBTP) via un pont disulfure biolabile en milieu réducteur. Nous avons conjugué ces synthons à un PNA cyclique dirigé contre la boucle SL3 du VIH et étudié la pénétration cellulaire par microscopie de fluorescence et cytométrie de flux. Nous avons montré que la pénétration cellulaire de ces conjugués de PNA n a pas lieu par un processus d endocytose, sensible à la température ou dépendant de l ATP, mais par une translocation passive à travers la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. Finalement, nous avons synthétisé un second type de vecteur constitué du TBTP lié, via un pont disulfure, au 2-mercaptoéthanol, qui, une fois conjugué aux PNAs par une liaison de type carbamate, est susceptible de délivrer ces derniers intacts dans le cytoplasme de la cellule (non liés à un groupement résiduel).Current antiviral drugs, directed against viral enzymes of HCV and HIV, lead to the fast emergence of resistant variants. An interesting approach to circumvent this problem consists in targeting untranslated RNA fragments. In a general way, two approaches are envisaged to target RNA fragments: the inhibition by small molecules and the antisens approach. We have synthesized 52 linear and cyclic peptides and peptide derivatives constituted by the amino-acids sequence Lys-Lys-Pro-Lys targeting the two E loops of the HCV RNA. In parallel, we have tried to improve the cellular uptake of antisens PNA. We have synthesized two cysteine synthon incorporating both a fluorescent group and a triphenylphosphonium derivative (TBTP) via an intracellular scissile disulphide bond. We have conjugated these synthons to a cyclic PNA-based compound and investigated the cellular uptake of these conjugates by fluorescence microscopy and flow cytometry. We have shown that the cellular uptake of these cyclic PNA conjugates is not driven by an endocytotic temperature-sensitive or ATP-dependent process but by a passive translocation through the lipid matrix of the cell membrane. Finally, we have synthesized a second vector constituted by TBTP linked, via a disulfide bond, to 2-mercaptoethanol, which, once conjugated to PNAs by a carbamate bond, could release an unaltered PNA in the cytoplasm of the cell.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Synthèse de PNA cycliques courts ciblant des boucles des ARN du VHC et du VIH-1 (activité antivirale et pénétration cellulaire)

Dans le cadre de la recherche de nouveaux anti-viraux, des séquences hautement conservées de l ARN génomique du VHC, structurées en tige-boucle, représentent des cibles thérapeutiques compte tenu de leur implication dans la réplication virale. Dans ce contexte, nous avons envisagé d inhiber le rôle joué par le domaine IV de l IRES au moyen d un PNA antisens cyclique complémentaire, via la formation d un complexe boucle-boucle de haute affinité. D autre part, nous avons élaboré un conjugué de fluorescéine et d un PNA cyclique complémentaire d une boucle de l ARN du VIH-1, afin d étudier la pénétration cellulaire de ce type de composés. Les PNA cycliques ont été synthétisés en phase liquide, suivant des stratégies originales. Les études biologiques ont mis en évidence que le PNA cyclique dirigé contre la boucle IV de l IRES inhibe la fonction de ce dernier. De plus, les études de pénétration cellulaire ont montré que les PNA cycliques ne traversent pas les membranes biologiques.Within the framework of an antiviral drug development, highly conserved stem-loop RNA sequences of the HCV genome represents therapeutic targets in the light of their involvements in essential steps of the viral life cycle. In this context, a cyclic molecule including a heptameric PNA sequence has been designed and synthesised in order to target the loop of the IRES domain IV of HCV through the formation of a kissing complex . In addition, a fluorescently labeled cyclic PNA, complementary of a HIV-1 RNA loop, has been prepared in order to investigate the cellular uptake of such compounds. The synthesis of the cyclic PNAs has been accomplished following original liquid-phase strategies. The biological studies showed that the cyclic PNA directed against the IRES stem-loop IV displayed an inhibitory activity of the IRES function. Moreover, the cellular uptake investigation showed that the cyclic PNA do not enter cells.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Un nouveau type de prodrogues anti-VIH (principe, synthèse et évaluation biologique)

Le traitement actuel des malades séropositifs (VIH+) est un traitement au long cours puisque l éradication du virus n est, pour le moment, pas possible. La diminution de la toxicité des médicaments actuellement utilisés est donc un sujet d intérêt. Dans ce cadre, nous avons pris comme modèle l AZT pour analyser s il est possible de diminuer sa toxicité par couplage de cet analogue de nucléoside à des peptides susceptibles d être libérés par la protéase du VIH tout en conservant son activité antivirale. L hydrolyse par la protéase du VIH pourrait conduire à une libération préférentielle dans les cellules affectées. 19 composés peptidiques esters de l AZT différents ont été synthétisés. Leur stabilité dans différents milieux biologiques a été évaluée. L évaluation de l activité anti-VIH montre que certains composés sont aussi actifs que l AZT. Cependant, aucun des sept composés sélectionnés n est hydrolysé par la protéase virale. 9 composés phosphoramidates différents de l AZT-MP ont été préparés. Seuls trois d entre eux sont stables dans le milieu de culture. Les six autres se dégradent rapidement. L évaluation de leurs activités anti-VIH montre qu ils sont moins actifs que l AZT et que les 19 composés esters.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Synthèse et interaction de PNA ciblant l'ARN TAR du VIH-1

Les médicaments utilisés en polythérapie anti-VIH ciblent des protéines virales (transcriptase inverse, protéase, go41). Ces thérapies ont permis de réduire le taux de mortalité mais génèrent de nombreux effets secondaires et conduisent à l émergence, parfois très rapide, de souches résistantes aux médicaments utilisés. La recherche de molécules qui agissent sur de nouvelles cibles virales reste donc nécessaire. Une piste consiste à cibler des fragments de l ARN du VIH qui sont impliqués dans es processus biologiques essentiels à la multiplication virale et dont les séquences sont conservées dans la plupart des souches virales. Dans ce cadre, le fragment d ARN TAR du VIH-1 constitue une cible privilégiée. Au cours de ce travail, nous avons développé deux stratégies en vue de cibler et d inhiber les fonctions biologiques de l ARN TAR. Une première stratégie a consisté à élaborer des PNA cycliques antisens (Peptide Nucleic Acids : analogues d ARN/ADN), susceptibles d établir un complexe très stable et spécifique avec la boucle de l ARN TAR. La seconde stratégie a consisté en l élaboration d un conjugué d arginine et de PNA, ciblant simultanément le renflement et la boucle de l ARN TAR. Dans une premier temps, nous avons donc mis au point la synthèse, en phase solide, de ces différentes molécules. Puis leur interaction avec l ARN TAR a été évaluée par dénaturation thermique, suivie par spectroscopie UV. Ces études ont montré que les PNA cycliques forment un complexe très stable et spécifique avec l ARN TAR. De même, une interaction entre le conjugué d arginine et de PNA et l ARN TAR a été mise en évidence.The drugs used in anti-HIV polytherapy target viral proteins (reverse transcriptase, protease, gp41). These therapies made it possible to reduce the death rate but generate many side effects and lead to emergence, sometimes very fast, of resistant strains to the drugs used. The research for molecules which act new viral targets thus remains necessary. A track consists in targeting fragments of the RNA of the HIV which is implied in biological processes essential with the viral multiplication and whose sequences are preserved in the majority of the viral strains. Within this framework, the HIV-1 TAR RNA fragment constitutes a privileged target. During this work, we developed two strategies in order to target and to inhibit the biological functions of TAR RNA. A first strategy consisted in working out cyclic PNA antisense (Peptide Nucleic Acids : RNA/DNA analogues), likely to establish a very stable and specific complex with the TAR RNA loop. The second strategy consisted of the development of one conjugate of arginine and PNA, simultaneously targeting the TAR RNA bugle and loop. Initially, we thus developed the synthesis, on solid phase, of these various molecules. Then their interaction with TAR RNA was evaluated by thermal denaturation, followed by UV spectroscopy. These studies showed that the cyclic PNA form a very stable and specific complex with TAR RNA. In the same way, an interaction enters combined arginine and PNA and TAR RNA were highlighted.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Synthèse de conjugués de PNA et d'acide aminé ciblant l'ARN du VIH-1

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An Efficient Biodelivery System for Antisense Polyamide Nucleic Acid (PNA)

With the aim of developing a general and straightforward procedure for the intracellular delivery of naked peptide nucleic acids (PNAs), we designed an intracellularly biodegradable triphenylphosphonium (TPP) cation based transporter system. In this system, TPP is linked, via a biolabile disulfide bridge, to an activated mercaptoethoxycarbonyl moiety, allowing its direct coupling to the N-terminal extremity of a free PNA through a carbamate bond. We found that such TPP-PNA-carbamate conjugates were highly stable in a cell culture medium containing fetal calf serum. In a glutathione-containing medium mimicking the cytosol, the conjugates were rapidly degraded into an unstable intermediate, which spontaneously decomposed, releasing the free PNA. Using a fluorescence-labeled PNA–TPP conjugate, we demonstrated that conjugates were taken up by cells. Efficient cellular uptake and release of the PNA into the cytosol was further confirmed by the anti-HIV activity measured for the TPP-conjugate of a 16-mer PNA targeting the TAR region of the HIV-1 genome. This conjugate exhibited an IC50 value of 1 μM, while the free 16-mer PNA did not inhibit replication of HIV in the same cellular test