Synthèse de peptides et de PNAs dirigés contre les ARN du VHC et du VIH-1 (activité antivirale et pénétration cellulaire)

Abstract

Les antiviraux actuels, dirigés contre les enzymes virales du VHC et du VIH, conduisent à l émergence rapide de souches résistantes. Une approche intéressante pour contourner ce problème consiste à cibler des fragments d ARN non traduits. De façon générale, deux approches sont envisagées pour cibler des fragments d ARN : l inhibition par des petites molécules et l approche antisens. Dans le cadre de la recherche de petites molécules dirigées contre les deux boucles E des domaines IIb et IIId de l IRES du VHC, nous avons synthétisé 52 peptides et dérivés de peptides linéaires et cycliques contenant la séquence d acides aminés Lys-Lys-Pro-Lys. En parallèle, nous avons tenté d améliorer la pénétration cellulaire d oligonucléotides antisens de type PNA. Ainsi, nous avons synthétisé deux synthons contenant un groupement fluorescent et une cystéine liée au cation lipophile 4-thiobutyltriphénylphosphonium (TBTP) via un pont disulfure biolabile en milieu réducteur. Nous avons conjugué ces synthons à un PNA cyclique dirigé contre la boucle SL3 du VIH et étudié la pénétration cellulaire par microscopie de fluorescence et cytométrie de flux. Nous avons montré que la pénétration cellulaire de ces conjugués de PNA n a pas lieu par un processus d endocytose, sensible à la température ou dépendant de l ATP, mais par une translocation passive à travers la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. Finalement, nous avons synthétisé un second type de vecteur constitué du TBTP lié, via un pont disulfure, au 2-mercaptoéthanol, qui, une fois conjugué aux PNAs par une liaison de type carbamate, est susceptible de délivrer ces derniers intacts dans le cytoplasme de la cellule (non liés à un groupement résiduel).Current antiviral drugs, directed against viral enzymes of HCV and HIV, lead to the fast emergence of resistant variants. An interesting approach to circumvent this problem consists in targeting untranslated RNA fragments. In a general way, two approaches are envisaged to target RNA fragments: the inhibition by small molecules and the antisens approach. We have synthesized 52 linear and cyclic peptides and peptide derivatives constituted by the amino-acids sequence Lys-Lys-Pro-Lys targeting the two E loops of the HCV RNA. In parallel, we have tried to improve the cellular uptake of antisens PNA. We have synthesized two cysteine synthon incorporating both a fluorescent group and a triphenylphosphonium derivative (TBTP) via an intracellular scissile disulphide bond. We have conjugated these synthons to a cyclic PNA-based compound and investigated the cellular uptake of these conjugates by fluorescence microscopy and flow cytometry. We have shown that the cellular uptake of these cyclic PNA conjugates is not driven by an endocytotic temperature-sensitive or ATP-dependent process but by a passive translocation through the lipid matrix of the cell membrane. Finally, we have synthesized a second vector constituted by TBTP linked, via a disulfide bond, to 2-mercaptoethanol, which, once conjugated to PNAs by a carbamate bond, could release an unaltered PNA in the cytoplasm of the cell.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF