Efeito da Hipertensão Renovascular 2r1c Sobre As Células Tronco da Medula Óssea de Camundongos

studos mostram que o número de algumas populações de células de medula óssea se encontra alterado em diferentes doenças cardiovasculares. A angiotensina II, além de um poente vasoconstritor, regula o crescimento e proliferação celular, atua como imunomodulador indutor de respostas inflamatórias e é capaz e aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio, levando ao estresse oxidativo. Apesar de alguns estudos relatarem que algumas doenças cardiovasculares afetam diferentes populações de células da medula óssea, pouco se sabe a respeito dos efeitos da hipertensão renovascular induzida por clipagem de um dos rins, a qual é angiotensina-II dependente, sobre estas células. Por isso, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre o número e a genotoxicidade das células tronco de medula óssea de camundongos in vivo. Para isso, camundongos C57 machos (21-24g) foram aleatoriamente separados em dois grupos Sham (n=10) e 2R1C (n=10). A hipertensão foi induzida no grupo 2R1C pela colocação de um clipe de aço ao redor da artéria renal esquerda. O grupo Sham foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação do clipe. Após 14 dias, os animais tiveram sua artéria carótida cateterizadas para medidas da pressão arterial e freqüência cardíaca. Em seguida, os animais foram eutanasiados, a medula óssea removida dos fêmures e tíbias e as células mononucleares isoladas, contadas em câmara de Neubauer e a viabilidade celular verificada. A identificação e quantificação das duas populações de células tronco da medula óssea foi realizada por imunofenotipagem. Uma alíquota das células mononucleares foi incubada com os anticorpos CD117-FITC e CD90.2-PE (5?l/106células) e com seus controles isotípicos. Em seguida as células tronco hematopoiéticas e mesenquimais foram quantificadas por citometria de fluxo. Para o estudo da genotoxicidade, as células mononucleares (2x104 células) foram misturadas com low melting point agarose e espalhadas sobre lâminas previamente cobertas com normal melting point agarose que foram colocadas em solução de lise. Em seguida, as lâminas foram dispostas na cuba, cobertas com tampão de desenrolamento alcalino e, posteriormente, submetidas à eletroforese, neutralizadas, fixadas e coradas com brometo de etídio para análise em microscópio de fluorescência. Os dados estão expressos como média ± EPM e variações percentuais em relação ao grupo controle. A análise estatística foi realizada por meio de teste t de Student. Como esperado os animais 2R1C apresentaram níveis maiores de pressão arterial sistólica (182±13 mmHg) quando comparados com os respectivos controles (133±2 mmHg). A viabilidade celular (Sham: 97%±0.54 vs. 2R1C: 96,75%±0.54) e o número de monócitos (Sham: 2.81±0.46 vs. 2R1C: 3.32±0.34 células/ml x 106) não foram diferentes entre os dois grupos. Entretanto, os animais 2R1C apresentaram diminuição do número de células indiferenciadas (2.26±0.13 células/ml x107) e simultâneo aumento do número de linfócitos (1.98±0.15 células/ml x 106) quando comparados com os animais Sham (Células indiferenciadas: 2,66±0,11 células/ml x107; Linfócitos: 1.22±0.25 células/ml x106). Além disso, o grupo hipertenso (0,41±0,16%) apresentou diminuição significante da população células tronco hematopoiética quando comparado com os animais Sham (1,75±0,18%). O número de células tronco mesenquimais não apresentou diferença entre os grupos (Sham: 2,36±0,61% vs. 2R1C: 1,48±0,22%). A análise de genotoxicidade revelou aumento da fragmentação do DNA dos camundongos hipertensos. Nossos resultados sugerem que a hipertensão renovascular 2R1C reduz o número de células tronco ao estimular a divisão assimétrica destas células, levando a sua diferenciação, o que pode ser confirmado pelo aumento do número de células inflamatórias produzidas na medula óssea. Além disso, neste modelo de hipertensão experimental ocorre aumento da produção de espécies reativas de oxigênio que são capazes de interagir com o DNA das células, fragmentando-o. Palavras-chave: Hipertensão renovascular. 2R1C. Angiotensina II. Célula tronco. Genotoxicidade. Espécies reativas de oxigênio

Where are we now with European forest multi-taxon biodiversity and where can we head to?

The European biodiversity and forest strategies rely on forest sustainable management (SFM) to conserve forest biodiversity. However, current sustainability assessments hardly account for direct biodiversity indicators. We focused on forest multi-taxon biodiversity to: i) gather and map the existing information; ii) identify knowledge and research gaps; iii) discuss its research potential. We established a research network to fit data on species, standing trees, lying deadwood and sampling unit description from 34 local datasets across 3591 sampling units. A total of 8724 species were represented, with the share of common and rare species varying across taxonomic classes: some included many species with several rare ones (e.g., Insecta); others (e.g., Bryopsida) were represented by few common species. Tree-related structural attributes were sampled in a subset of sampling units (2889; 2356; 2309 and 1388 respectively for diameter, height, deadwood and microhabitats). Overall, multi-taxon studies are biased towards mature forests and may underrepresent the species related to other developmental phases. European forest compositional categories were all represented, but beech forests were over-represented as compared to thermophilous and boreal forests. Most sampling units (94%) were referred to a habitat type of conservation concern. Existing information may support European conservation and SFM strategies in: (i) methodological harmonization and coordinated monitoring; (ii) definition and testing of SFM indicators and thresholds; (iii) data-driven assessment of the effects of environmental and management drivers on multi-taxon forest biological and functional diversity, (iv) multi-scale forest monitoring integrating in-situ and remotely sensed information

Gene Expression Profiling in Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2A

Limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A) is a recessive genetic disorder caused by mutations in calpain 3 (CAPN3). Calpain 3 plays different roles in muscular cells, but little is known about its functions or in vivo substrates. The aim of this study was to identify the genes showing an altered expression in LGMD2A patients and the possible pathways they are implicated in. Ten muscle samples from LGMD2A patients with in which molecular diagnosis was ascertained were investigated using array technology to analyze gene expression profiling as compared to ten normal muscle samples. Upregulated genes were mostly those related to extracellular matrix (different collagens), cell adhesion (fibronectin), muscle development (myosins and melusin) and signal transduction. It is therefore suggested that different proteins located or participating in the costameric region are implicated in processes regulated by calpain 3 during skeletal muscle development. Genes participating in the ubiquitin proteasome degradation pathway were found to be deregulated in LGMD2A patients, suggesting that regulation of this pathway may be under the control of calpain 3 activity. As frizzled-related protein (FRZB) is upregulated in LGMD2A muscle samples, it could be hypothesized that β-catenin regulation is also altered at the Wnt signaling pathway, leading to an incorrect myogenesis. Conversely, expression of most transcription factor genes was downregulated (MYC, FOS and EGR1). Finally, the upregulation of IL-32 and immunoglobulin genes may induce the eosinophil chemoattraction explaining the inflammatory findings observed in presymptomatic stages. The obtained results try to shed some light on identification of novel therapeutic targets for limb-girdle muscular dystrophies

Caracterização por citometria de fluxo das células de sangue, medula óssea e aorta de camundongos hipertensos

Campagnaro BP. Utilização da citometria de fluxo para análise do efeito da hipertensão renovascular 2R1C sobre células hematopoiéticas e endoteliais de camundongos. [tese] Vitória: Universidade Federal do Espírito Santo, 2012. 167f. A angiotensina II foi considerada durante muito tempo apenas como um hormônio vasoativo. Entretanto, sabe-se que além de um potente vasoconstritor, a angiotensina II apresenta funções biológicas importantes na regulação do crescimento e proliferação celular, além de atuar como imunomodulador indutor de respostas inflamatórias. Apesar de muitos estudos demonstrarem que a angiotensina II aumenta a produção de ROS, levando a ativação de mecanismos de apoptose em órgãos-alvo da hipertensão, pouco se sabe a respeito dos efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células hematopoiéticas e endoteliais. Por isso, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea, por citometria de fluxo, em camundongos. Para isso, camundongos C57 machos (~23g) foram separados em dois grupos Sham (n=10) e 2R1C (n=10). A hipertensão foi induzida no grupo 2R1C pela colocação de um clipe de aço ao redor da artéria renal esquerda. O grupo Sham foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação do clipe. Após 14 dias, os animais tiveram sua artéria carótida cateterizadas para medidas hemodinâmicas. Em seguida, os animais foram eutanasiados, e o sangue coletado por punção cardíaca. Após a perfusão, as células endoteliais foram mecanicamente isoladas da aorta torácica e mantidas em solução de HBSS. As células da medula óssea foram isoladas dos fêmures e tíbias e colocadas em PBS. As células foram quantificadas em câmara de Neubauer. A identificação de células endoteliais foi realizada por imunofenotipagem utilizando o anticorpo CD31-APC (5μl/106 células). Para análise do estresse oxidativo 106 células foram diluídas em PBS e incubadas com 160μM de DHE e 20mM de DCFH-DA por 30 minutos a 37ºC no escuro e, depois lavadas e ressuspendidas em 0,5ml de PBSiFBS. Para a análise de apoptose 106 células foram ressuspendidas em tampão de ligação e incubadas com 5μl de anexina V-FITC e 5μl de iodeto de propídeo (PI) a temperatura ambiente, por 15 minutos, no escuro e foram ressuspendidas em 0,5ml de tampão de ligação. Para avaliar o conteúdo de DNA, 106 células foram fixadas em etanol 70% gelado, lavadas com PBS e ressuspendidas em 200μl de solução de coloração (20mg/ml RNAse, 500μg/ml PI, 10% Triton X-100). As amostras foram mantidas em gelo até o momento da aquisição dos dados pelo citômetro de fluxo FACSCanto II. Em cada experimento foram avaliadas 30000 células. Os dados foram analisados com o auxílio dos softwares BDFACSDiva e FCS Express 4.0. Os dados estão expressos como média±EPM e a análise estatística foi realizada por teste t de Student ou Wilcoxon. Como esperado os animais 2R1C apresentaram níveis maiores de pressão arterial (144±5,6 mmHg) quando comparados com os respectivos controles (103±0,8 mmHg). A análise por citometria de fluxo mostrou aumento na produção de O2- nas células sanguíneas (Sham: 941±63 vs. 2R1C: 2155±289 a.u.), endoteliais (Sham: 432±51 vs. 2R1C: 2630±184 a.u.) e da medula óssea (Sham: 1309±175 vs. 2R1C: 12036±2205 a.u.) de animais 2R1C quando compara aos animais Sham. Simultaneamente, também observamos aumento na produção de H2O2 nas células sanguíneas (Sham: 252±23 vs. 2R1C: 531±48 a.u.), endoteliais (Sham: 300±30 vs. 2R1C: 1049±112 a.u.) e da medula óssea (Sham: 2107±222 vs. 2R1C: 7517±1067 a.u.) dos animais hipertensos comparado aos animais normotensos. A análise de apoptose pela marcação com AnexinaV-FITC/PI, mostrou que os animais hipertensos apresentam mais apoptose em células sanguíneas (Q2Sham: 1.5±0.1 vs. Q22R1C: 15.3±3.8; Q4Sham: 1.6±0.2 vs. Q42R1C: 18.3±4.3 %), endoteliais (Q2Sham: 1.2±0.2 vs. Q22R1C: 21.1±3.0; Q4Sham: 12.5±2.6 vs. Q42R1C: 31.2±2.4 %) e de medula óssea (Q2Sham: 5.7±0.6 vs. Q22R1C: 22.5±2.5; Q4Sham: 12.9±1.1 vs. Q42R1C: 27.2±2.5 %) nos animais do grupo 2R1C quando comparado aos Sham. Além disso, as células da medula óssea dos animais 2R1C (1.54±0.26 %) apresentaram aumento na fragmentação do DNA quando comparado com os animais Sham (0.50±0.09 %). Nossos resultados sugerem que a hipertensão renovascular 2R1C aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio levando ao estresse oxidativo e, conseqüentemente a apoptose em células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea isoladas de camundongos hipertensos. Além disso, neste modelo de hipertensão experimental as espécies reativas de oxigênio aumentadas interagem com o DNA das células, fragmentando-o. Palavras-chave: Hipertensão renovascular. Angiotensina II. Citometria de fluxo. ROS. Apoptose. Fragmentação do DN

Impacts of long chain fatty acids injection on biogas reactors performance stability and microbial community structure and function

Biogas plants often face multivarious challenges during the operation, with the accumulation of long chain fatty acids from the influent feedstock being one of the most important. Although the negative effect of lipids excess in anaerobic digestion is known, there is limited knowledge of what happens at transcriptomics level when the microbial community is exposed to such kind of incidents. The present study aimed to shed light on the response of the biogas microbiome under an impact load of long chain fatty acids. The utilization of genome-centric metagenomics has provided novel insights into the microcosm of biogas reactors. Remarkably, this approach led for the first time to discovery of Nigerium sp. and has also illuminated the functionalities of this microorganism within this specific environment. Furthermore, a revelation emerged associated with the ability of Candidatus Hydrogenedentes sp. for & beta;-oxidation. The transcriptional analysis revealed the Cluster of Orthologous Group (COG) category "Lipid metabolism" as the dominant category in up-regulated genes. Furthermore, activation of genes encoding cell motility proteins, including flagellar assembly and bacterial chemotaxis, was evidenced

Pilot-scale biomethanation in a trickle bed reactor: Process performance and microbiome functional reconstruction

Biogas upgrading is an emerging technology offering unique opportunities for further exploitation of biomethane as fuel for vehicles or direct injection into the gas grid, expanding the conventional use of biogas for combined heat and electricity generation. Up to date, most of the studies exploring the potential of biological carbon dioxide hydrogenation was performed at laboratory scale systems, hampering the evaluation of the process under real environmental conditions. The current work demonstrates the performance of a pilot trickle bed reactor that was fed with real biogas as CO2 source under progressively increased gas provision rates. Additionally, the study is supported by a genome-centric metagenomic analysis to gain deep insights into the microbiome of the reactor. A maximum methane content of 98.5% was achieved at a gas retention time of 5 h. Stand-by periods in which no influent gas was provided in the reactor did not lead to fatal deterioration of the overall process, as the biomethanation efficiency was recovered after a certain period of time. Samples obtained from three different layers of the packing material, the liquid phase of the reactor and the inoculum demonstrated a distinct clustering of microbial members. The provision of the nutrient media from the top layer led to the enrichment of specific bacteria, such as Clostridiaceae DTU-pt_113, whose genome profile contains Veg-family genes, which are known to be associated with biofilm formation. Similarly, the injection of influent gases from the bottom of the reactor favoured the proliferation of hydrogenotrophic methanogens, solely belonging to family Methanobacteriaceae

Effect of ammonia on anaerobic digestion of municipal solid waste: Inhibitory performance, bioaugmentation and microbiome functional reconstruction

The bioaugmentation is crucial to improve the energy-efficient process for anaerobic digestion of organic wastes at high ammonia levels. Genomic insights into the intricate microbial networks at a high ammonia level remain underexplored. The present study showed that the addition of Methanoculleus sp. DTU887 remarkably enhanced the methane production yield of organic fraction of municipal solid waste by 21% and decreased the volatile fatty acids by 10% when compared to the period before bioaugmentation. Genome-centric metagenomics reports the functional contribution of microbial members during organic waste degradation under the extremely high level of 13.5 g NH4+-N/L. Specifically, metabolic reconstruction revealed that these organisms have the potential to perform fermentative and acetogenic catabolism, a process facilitated by energy conservation-related with H2/CO2 metabolism. Peptococcaceae spp. (DTU903, DTU900, and DTU895). and Tissierellales sp. DTU879 could degrade the organic waste hydrolysis product, i.e., glucose to acetate and H2. Tissierellales sp. DTU879 and Syntrophaceticus sp. DTU783 could degrade the derived acetate. The H2 scavenging Methanoculleus sp. DTU887 performs complementary metabolic reactions with Peptococcaceae spp., Tissierellales sp. and Syntrophaceticus sp., indicating syntrophic glucose and acetate degradation. This research offers the first insight that the key organisms form a syntrophy-supported food web in response to the bioaugmentation with ammonia tolerant methanogens performed in an AD system subjected to severe ammonia inhibition