The integrity of the α-helical domain of intestinal fatty acid binding protein is essential for the collision-mediated transfer of fatty acids to phospholipid membranes

Intestinal FABP (IFABP) and liver FABP (LFABP), homologous proteins expressed at high levels in intestinal absorptive cells, employ markedly different mechanisms of fatty acid transfer to acceptor model membranes. Transfer from IFABP occurs during protein-membrane collisional interactions, while for LFABP transfer occurs by diffusion through the aqueous phase. In addition, transfer from IFABP is markedly faster than from LFABP. The overall goal of this study was to further explore the structural differences between IFABP and LFABP which underlie their large functional differences in ligand transport. In particular, we addressed the role of the αI-helix domain in the unique transport properties of intestinal FABP. A chimeric protein was engineered with the 'body' (ligand binding domain) of IFABP and the αI-helix of LFABP (α(I)LβIFABP), and the fatty acid transfer properties of the chimeric FABP were examined using a fluorescence resonance energy transfer assay. The results showed a significant decrease in the absolute rate of FA transfer from α(I)LβIFABP compared to IFABP. The results indicate that the αI-helix is crucial for IFABP collisional FA transfer, and further indicate the participation of the αII-helix in the formation of a protein-membrane "collisional complex". Photo-crosslinking experiments with a photoactivable reagent demonstrated the direct interaction of IFABP with membranes and further support the importance of the αI helix of IFABP in its physical interaction with membranes.Fil: Franchini, Gisela Raquel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Storch, J.. Rutgers University; Estados UnidosFil: Córsico, Betina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Técnicas bioquímicas para el estudio de proteínas

Con la finalidad de realizar estudios estructurales y funcionales de una proteína, uno de los pasos fundamentales es obtenerla en forma pura. Luego del proceso de purificación deben llevarse a cabo una serie de procedimientos que permitan controlar el grado de pureza y también realizar una caracterización inicial de dichas proteínas. Entre las técnicas bioquímicas más comúnmente utilizadas y que aportan información complementaria podemos mencionar las siguientes: electroforesis, cromatografía de exclusión molecular, centrifugación analítica y análisis de entrecruzamiento químico, entre otras. Este capítulo está destinado a que el alumno tenga una primera aproximación a una serie de técnicas que permiten caracterizar y controlar el grado de pureza de una proteína. Si bien esto no pretende ser un manual técnico, se aportarán los fundamentos, los procedimientos básicos y el análisis de la información obtenida a partir de las técnicas que se describen.Facultad de Ciencias Exacta

De novo lipogenesis at the mitotic exit is used for nuclear envelope reassembly/expansion: Implications for combined chemotherapy

Mitosis has been traditionally considered a metabolically inactive phase. We have previously shown, however, that extensive alterations in lipids occur as the cells traverse mitosis, including increased de novo fatty acid (FA) and phosphatidylcholine (PtdCho) synthesis and decreased lysophospholipid content. Given the diverse structural and functional properties of these lipids, we sought to study their metabolic fate and their importance for cell cycle completion. Here we show that FA and PtdCho synthesized at the mitotic exit are destined to the nuclear envelope. Importantly, FA and PtdCho synthesis, but not the decrease in lysophospholipid content, are necessary for cell cycle completion beyond G2/M. Moreover, the presence of alternative pathways for PtdCho synthesis renders the cells less sensitive to its inhibition than to the impairment of FA synthesis. FA synthesis, thus, represents a cell cycle-related metabolic vulnerability that could be exploited for combined chemotherapy. We explored the combination of fatty acid synthase (FASN) inhibition with agents that act at different phases of the cell cycle. Our results show that the effect of FASN inhibition may be enhanced under some drug combinations.Fil: Rodriguez Sawicki, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Garcia, Karina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Córsico, Betina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Scaglia, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Metabolismo lipídico en células tumorales: rol de FABP5

El cáncer es la principal causa de muerte a nivel mundial. El estudio de los mecanismos que intervienen en el desarrollo del cáncer es importante para la detección de nuevos blancos terapéuticos. Las células cancerosas presentan una reprogramación metabólica direccionada hacia la obtención de biomoléculas necesarias para la duplicación celular. Si bien se demostró la importancia de la síntesis de membranas para la proliferación celular, se desconocen diversos aspectos del metabolismo lipídico en células tumorales. Las proteínas que unen ácidos grasos (FABPs) son proteínas de bajo peso molecular 14- 15kDa, citosólicas que unen ácidos grasos de cadena larga con alta afinidad. Se ha estudiado su estructura, distribución tisular y su mecanismo de transferencia de ácidos grasos, sin embargo, su función aún está en discusión. La existencia de nueve FABPs y la presencia simultánea de más de una isoforma en un tejido sugiere que las mismas difieren en su función. Se propone que podrían transportar ácidos grasos a diferentes compartimentos celulares dirigiéndolos así hacia su oxidación, utilización en síntesis de lípidos complejos y regulación de factores transcripcionales. FABP5, epidermal o de queratinocito, presenta una expresión ubicua. A diferencia de otras isoformas FABP5 ha sido asociada positivamente con la progresión y el desarrollo de ciertos cánceres, en especial próstata y mama. Su función en el metabolismo de los mismos es, sin embargo, desconocida.Facultad de Ciencias Médica

Fatty acid transfer from intestinal fatty acid binding protein to membranes: Electrostatic and hydrophobic interactions

Intestinal fatty acid binding protein (IFABP) is thought to participate in the intracellular transport of fatty acids (FAs). Fatty acid transfer from IFABP to phospholipid membranes is proposed to occur during protein-membrane collisional interactions. In this study, we analyzed the participation of electrostatic and hydrophobic interactions in the collisional mechanism of FA transfer from IFABP to membranes. Using a fluorescence resonance energy transfer assay, we examined the rate and mechanism of transfer of anthroyloxy-fatty acid analogs a) from IFABP to phospholipid membranes of different composition; b) from chemically modified IFABPs, in which the acetylation of surface lysine residues eliminated positive surface charges; and c) as a function of ionic strength. The results show clearly that negative charges on the membrane surface and positive charges on the protein surface are important for establishing the "collisional complex," during which fatty acid transfer occurs. In addition, changes in the hydrophobicity of the protein surface, as well as the hydrophobic volume of the acceptor vesicles, also influenced the rate of fatty acid transfer. Thus, ionic interactions between IFABP and membranes appear to play a primary role in the process of fatty acid transfer to membranes, and hydrophobic interactions can also modulate the rates of ligand transfer.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Fatty acid transfer from intestinal fatty acid binding protein to membranes: Electrostatic and hydrophobic interactions

Intestinal fatty acid binding protein (IFABP) is thought to participate in the intracellular transport of fatty acids (FAs). Fatty acid transfer from IFABP to phospholipid membranes is proposed to occur during protein-membrane collisional interactions. In this study, we analyzed the participation of electrostatic and hydrophobic interactions in the collisional mechanism of FA transfer from IFABP to membranes. Using a fluorescence resonance energy transfer assay, we examined the rate and mechanism of transfer of anthroyloxy-fatty acid analogs a) from IFABP to phospholipid membranes of different composition; b) from chemically modified IFABPs, in which the acetylation of surface lysine residues eliminated positive surface charges; and c) as a function of ionic strength. The results show clearly that negative charges on the membrane surface and positive charges on the protein surface are important for establishing the "collisional complex," during which fatty acid transfer occurs. In addition, changes in the hydrophobicity of the protein surface, as well as the hydrophobic volume of the acceptor vesicles, also influenced the rate of fatty acid transfer. Thus, ionic interactions between IFABP and membranes appear to play a primary role in the process of fatty acid transfer to membranes, and hydrophobic interactions can also modulate the rates of ligand transfer.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Lipid-free Antigen B subunits from echinococcus granulosus: oligomerization, ligand binding, and membrane interaction properties

Background: The hydatid disease parasite Echinococcus granulosus has a restricted lipid metabolism, and needs to harvest essential lipids from the host. Antigen B (EgAgB), an abundant lipoprotein of the larval stage (hydatid cyst), is thought to be important in lipid storage and transport. It contains a wide variety of lipid classes, from highly hydrophobic compounds to phospholipids. Its protein component belongs to the cestode-specific Hydrophobic Ligand Binding Protein family, which includes five 8-kDa isoforms encoded by a multigene family (EgAgB1-EgAgB5). How lipid and protein components are assembled into EgAgB particles remains unknown. EgAgB apolipoproteins self-associate into large oligomers, but the functional contribution of lipids to oligomerization is uncertain. Furthermore, binding of fatty acids to some EgAgB subunits has been reported, but their ability to bind other lipids and transfer them to acceptor membranes has not been studied.<p></p> Methodology/Principal Findings: Lipid-free EgAgB subunits obtained by reverse-phase HPLC were used to analyse their oligomerization, ligand binding and membrane interaction properties. Size exclusion chromatography and cross-linking experiments showed that EgAgB8/2 and EgAgB8/3 can self-associate, suggesting that lipids are not required for oligomerization. Furthermore, using fluorescent probes, both subunits were found to bind fatty acids, but not cholesterol analogues. Analysis of fatty acid transfer to phospholipid vesicles demonstrated that EgAgB8/2 and EgAgB8/3 are potentially capable of transferring fatty acids to membranes, and that the efficiency of transfer is dependent on the surface charge of the vesicles.<p></p> Conclusions/Significance: We show that EgAgB apolipoproteins can oligomerize in the absence of lipids, and can bind and transfer fatty acids to phospholipid membranes. Since imported fatty acids are essential for Echinococcus granulosus, these findings provide a mechanism whereby EgAgB could engage in lipid acquisition and/or transport between parasite tissues. These results may therefore indicate vulnerabilities open to targeting by new types of drugs for hydatidosis therapy.<p></p&gt

Metabolismo lipídico en células tumorales: rol de FABP5

El cáncer es la principal causa de muerte a nivel mundial. El estudio de los mecanismos que intervienen en el desarrollo del cáncer es importante para la detección de nuevos blancos terapéuticos. Las células cancerosas presentan una reprogramación metabólica direccionada hacia la obtención de biomoléculas necesarias para la duplicación celular. Si bien se demostró la importancia de la síntesis de membranas para la proliferación celular, se desconocen diversos aspectos del metabolismo lipídico en células tumorales. Las proteínas que unen ácidos grasos (FABPs) son proteínas de bajo peso molecular 14- 15kDa, citosólicas que unen ácidos grasos de cadena larga con alta afinidad. Se ha estudiado su estructura, distribución tisular y su mecanismo de transferencia de ácidos grasos, sin embargo, su función aún está en discusión. La existencia de nueve FABPs y la presencia simultánea de más de una isoforma en un tejido sugiere que las mismas difieren en su función. Se propone que podrían transportar ácidos grasos a diferentes compartimentos celulares dirigiéndolos así hacia su oxidación, utilización en síntesis de lípidos complejos y regulación de factores transcripcionales. FABP5, epidermal o de queratinocito, presenta una expresión ubicua. A diferencia de otras isoformas FABP5 ha sido asociada positivamente con la progresión y el desarrollo de ciertos cánceres, en especial próstata y mama. Su función en el metabolismo de los mismos es, sin embargo, desconocida.Facultad de Ciencias Médica

Metabolismo lipídico en células tumorales: rol de FABP5

El cáncer es la principal causa de muerte a nivel mundial. El estudio de los mecanismos que intervienen en el desarrollo del cáncer es importante para la detección de nuevos blancos terapéuticos. Las células cancerosas presentan una reprogramación metabólica direccionada hacia la obtención de biomoléculas necesarias para la duplicación celular. Si bien se demostró la importancia de la síntesis de membranas para la proliferación celular, se desconocen diversos aspectos del metabolismo lipídico en células tumorales. Las proteínas que unen ácidos grasos (FABPs) son proteínas de bajo peso molecular 14- 15kDa, citosólicas que unen ácidos grasos de cadena larga con alta afinidad. Se ha estudiado su estructura, distribución tisular y su mecanismo de transferencia de ácidos grasos, sin embargo, su función aún está en discusión. La existencia de nueve FABPs y la presencia simultánea de más de una isoforma en un tejido sugiere que las mismas difieren en su función. Se propone que podrían transportar ácidos grasos a diferentes compartimentos celulares dirigiéndolos así hacia su oxidación, utilización en síntesis de lípidos complejos y regulación de factores transcripcionales. FABP5, epidermal o de queratinocito, presenta una expresión ubicua. A diferencia de otras isoformas FABP5 ha sido asociada positivamente con la progresión y el desarrollo de ciertos cánceres, en especial próstata y mama. Su función en el metabolismo de los mismos es, sin embargo, desconocida.Facultad de Ciencias Médica

FABP1: UN ENFOQUE TRANSCRIPTÓMICO EN BÚSQUEDA DE SUS FUNCIONES

Las proteínas que unen ácidos grasos (FABPs) son proteínas pequeñas citoplasmáticas que se expresan en casi todos los tejidos de mamíferos. Estudios previos de nuestro y otros laboratorios han ayudado a elucidar los mecanismos de transferencia de ácidos grasos (FA) por distintas FABPs, así como sus estructuras y distribución tisular. Sus funciones, sin embargo, aún están en discusión. Trabajo previo de nuestro laboratorio mostró que la disminución de FABP1 conlleva a efectos pleiotrópicos en el metabolismo de lípidos, proliferación celular y adhesión, entre otros procesos, en enterocitos humanos. Una de las funciones propuestas de las FABPs es la regulación de la expresión génica por medio del direccionamiento de ligandos hacia receptores nucleares, especialmente receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPAR). La regulación de los receptores nucleares por FABPs es compleja y, en muchos casos, no clara. Dada la plétora de targets de estos receptores que podrían estar afectados por FABP1, un reto importante es identificar los procesos específicos en los que participa y los blancos responsables de la respuesta biológica. El presente plan propone estudiar, por medio de secuenciación masiva de RNA, qué vías reguladas transcripcionalmente por esta FABP son responsables de las alteraciones fenotípicas observadas previamente. Bajo nuestra hipótesis de trabajo, FABP1 regula el metabolismo lipídico y la proliferación celular en enterocitos a través de la alteración de la expresión génica mediada por receptores nucleares. El objetivo de este trabajo es en primer lugar analizar el perfil de expresión resultante de la disminución de FABP1 por medio de secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq). Se analizará el perfil de expresión diferencial de genes (DGE) por la disminución de FABP1 en células en cultivo. En una etapa ulterior, se validarán los principales DGE por PCR en tiempo real y Western Blot; se validarán los receptores comunes que surjan del análisis de las secuencias upstream de DGE con ensayos de genes reporteros, RNA pequeños de interferencia (siRNA) y agonistas/antagonistas específicos de receptores nucleares; se validarán los modelos celulares con distintos modelos celulares. Así, aportaremos al conocimiento de las funciones de FABPs, su importancia en el metabolismo lipídico y la biología celular. Este trabajo presenta a su vez potencial impacto en muchas enfermedades crónicas en las que se ha implicado a distintos receptores nucleares y FABPs como la esteatosis hepática, los síndromes malabsortivos, la insulino-resistencia y el cáncer, entre otras