Relação entre as vias de reparo de quebras duplas e excisão de nucleotídios em resposta às lesões induzidas por inibidores de topoisomerase 2

O câncer se caracteriza por uma doença multifatorial e de alta complexidade, tornando-se, nas últimas décadas, um problema de saúde pública mundial. Dentre as principais abordagens de tratamento encontra-se a quimioterapia, que utiliza drogas com diferentes mecanismos de ação para atacar e controlar a proliferação das células tumorais, levando-as à morte. Existem então muitas estratégias para o combate desta doença, no entanto, apesar da ampla variedade e eficiência de muitos quimioterápicos, muitos tumores ainda apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Alguns mecanismos podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões geradas pelos quimioterápicos são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade da droga. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por inibidores de Topoisomerase 2 (TOP2), uma importante classe de quimioterápicos utilizada no tratamento de tumores de mama, osteosarcomas, leucemias, entre outros. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo (1) compreender melhor o mecanismo de formação de lesões no DNA pelos inibidores de TOP2 e a influência da via NER, mais especificamente da proteína CSB, na resposta a estas lesões mediando a formação de quebras duplas no DNA; e (2) aplicar in vitro em células de câncer de mama um protocolo quimioterápico com um fármaco inibidor de TOP2 semelhante ao utilizado na clínica e avaliar a resposta destas células a longo prazo, mesmo após o final do tratamento, bem como analisar a expressão de genes da via NER em diferentes pontos deste protocolo. Além de apresentar uma revisão da literatura que aborda o papel das vias de reparo de DNA, com maior enfoque na via NER, em resposta a inibidores de TOP2, os demais trabalhos desenvolvidos durante a tese demonstram haver uma interação física da proteína CSB com TOP2 em resposta à tratamentos com inibidores de TOP2, encontrado por co-imunoprecipitação. Além disso, verificamos que a ausência de TOP2 por silenciamento gênico, mas não a sua inibição, favorece o acúmulo de estruturas como R-loops, híbridos de DNA:RNA que causam instabilidade genômica, no entanto não conseguimos relacionar a presença de CSB neste contexto. Com relação à aplicação do protocolo clínico nas células tumorais de mama, observamos que a proliferação das células tratadas foi bastante reduzida durante todo o protocolo utilizado, combinação de Doxorrubicina (DOX) e Paclitaxel. No entanto, quando as células foram acompanhadas ao final dos ciclos de DOX, ou ao final do protocolo completo, ambas as situações demonstraram que as células remanescentes apresentaram potencial para retomar seu crescimento. Ainda assim, de maneira geral pode-se dizer que a longo-prazo o protocolo utilizado apresentou uma boa eficiência em controlar esta proliferação. Ao analisar os níveis de expressão de diferentes genes da via NER após 1 ou 4 ciclos de tratamento com DOX constatamos uma maior expressão dos genes XPA, XPC, ERCC6 e ERCC4, bem como do gene MRE11, envolvido na reparação de quebras duplas, em relação às células não tratadas.Cancer is characterized by a multifactorial and highly complex disease, becoming, in the last decades, a world public health problem. Among the main approaches to treat this disease is chemotherapy, which uses drugs with different mechanisms of action to attack and control the proliferation of tumor cells, leading to death. Nowadays there are many strategies to combat this disease, however, despite the wide variety and efficiency of the chemotherapeutic drugs, many tumors still show resistance, resulting in a partially or totally ineffective treatment. There are some mechanisms known to be related to the development of this resistance profile, and the most studied one is the modulation of membrane proteins to increase the efflux of the drugs from the cells. Besides that, changes in DNA repair pathways also contribute to tumor resistance, since the chemotherapy-generated lesions can be removed before they become cytotoxic, thus reducing the effectiveness of the drug. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing and involvement of this pathway in response to Topoisomerase 2 (TOP2) inhibitors-induced lesions, which is an important class of chemotherapeutic used in the treatment of breast tumors, osteosarcomas, leukemias, etc. Considering that, the works presented in this thesis had 2 main goals: (1) understand the mechanism by which TOP2 inhibitors generate their lesions in the DNA and their influence of NER, more specifically CSB protein, in response to these lesions to mediate Double Strand Breaks (DSBs) in the DNA; and (2) apply a chemotherapy protocol using a TOP2 inhibitor similar to what is used in clinical practice and evaluate the long-term response of these cells, as well as analyze NER-genes expression at different time- points in this protocol. We present here a review that addresses the role of DNA repair pathways, focusing more on NER, in response to TOP2 inhibitors; besides that, the other works developed during the thesis demonstrate a physical interaction of CSB and TOP2 in response to treatments with TOP2 inhibitors, found by co-immunoprecipitation. In addition, we found that the absence of TOP2 by siRNA, but not its pharmacological inhibition, favors the accumulation of structures such as R-loops, DNA:RNA hybrids that cause genomic instability, but we could not relate the presence of CSB in this context. Regarding the application of the clinical protocol in breast tumor cells, we observed that the proliferation of the treated cells was greatly reduced throughout the protocol used, a combination of Doxorubicin (DOX) and Paclitaxel (PCTX). However, when cells were monitored at the end of DOX cycles, or at the end of the complete protocol, both situations demonstrated that the remaining cells had the potential to resume their growth. Nevertheless, in general we can conclude that at a long-term analysis, the protocol used presented a good efficiency in controlling this proliferation. When analyzing the expression levels of different NER genes after 1 or 4 DOX cycles we found a higher expression of XPA, XPC, ERCC6 and ERCC4 genes, as well as of MRE11, involved in the repair of DSBs, in relation to untreated cells

Relação entre as vias de reparo de quebras duplas e excisão de nucleotídios em resposta às lesões induzidas por inibidores de topoisomerase 2

O câncer se caracteriza por uma doença multifatorial e de alta complexidade, tornando-se, nas últimas décadas, um problema de saúde pública mundial. Dentre as principais abordagens de tratamento encontra-se a quimioterapia, que utiliza drogas com diferentes mecanismos de ação para atacar e controlar a proliferação das células tumorais, levando-as à morte. Existem então muitas estratégias para o combate desta doença, no entanto, apesar da ampla variedade e eficiência de muitos quimioterápicos, muitos tumores ainda apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Alguns mecanismos podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões geradas pelos quimioterápicos são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade da droga. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por inibidores de Topoisomerase 2 (TOP2), uma importante classe de quimioterápicos utilizada no tratamento de tumores de mama, osteosarcomas, leucemias, entre outros. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo (1) compreender melhor o mecanismo de formação de lesões no DNA pelos inibidores de TOP2 e a influência da via NER, mais especificamente da proteína CSB, na resposta a estas lesões mediando a formação de quebras duplas no DNA; e (2) aplicar in vitro em células de câncer de mama um protocolo quimioterápico com um fármaco inibidor de TOP2 semelhante ao utilizado na clínica e avaliar a resposta destas células a longo prazo, mesmo após o final do tratamento, bem como analisar a expressão de genes da via NER em diferentes pontos deste protocolo. Além de apresentar uma revisão da literatura que aborda o papel das vias de reparo de DNA, com maior enfoque na via NER, em resposta a inibidores de TOP2, os demais trabalhos desenvolvidos durante a tese demonstram haver uma interação física da proteína CSB com TOP2 em resposta à tratamentos com inibidores de TOP2, encontrado por co-imunoprecipitação. Além disso, verificamos que a ausência de TOP2 por silenciamento gênico, mas não a sua inibição, favorece o acúmulo de estruturas como R-loops, híbridos de DNA:RNA que causam instabilidade genômica, no entanto não conseguimos relacionar a presença de CSB neste contexto. Com relação à aplicação do protocolo clínico nas células tumorais de mama, observamos que a proliferação das células tratadas foi bastante reduzida durante todo o protocolo utilizado, combinação de Doxorrubicina (DOX) e Paclitaxel. No entanto, quando as células foram acompanhadas ao final dos ciclos de DOX, ou ao final do protocolo completo, ambas as situações demonstraram que as células remanescentes apresentaram potencial para retomar seu crescimento. Ainda assim, de maneira geral pode-se dizer que a longo-prazo o protocolo utilizado apresentou uma boa eficiência em controlar esta proliferação. Ao analisar os níveis de expressão de diferentes genes da via NER após 1 ou 4 ciclos de tratamento com DOX constatamos uma maior expressão dos genes XPA, XPC, ERCC6 e ERCC4, bem como do gene MRE11, envolvido na reparação de quebras duplas, em relação às células não tratadas.Cancer is characterized by a multifactorial and highly complex disease, becoming, in the last decades, a world public health problem. Among the main approaches to treat this disease is chemotherapy, which uses drugs with different mechanisms of action to attack and control the proliferation of tumor cells, leading to death. Nowadays there are many strategies to combat this disease, however, despite the wide variety and efficiency of the chemotherapeutic drugs, many tumors still show resistance, resulting in a partially or totally ineffective treatment. There are some mechanisms known to be related to the development of this resistance profile, and the most studied one is the modulation of membrane proteins to increase the efflux of the drugs from the cells. Besides that, changes in DNA repair pathways also contribute to tumor resistance, since the chemotherapy-generated lesions can be removed before they become cytotoxic, thus reducing the effectiveness of the drug. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing and involvement of this pathway in response to Topoisomerase 2 (TOP2) inhibitors-induced lesions, which is an important class of chemotherapeutic used in the treatment of breast tumors, osteosarcomas, leukemias, etc. Considering that, the works presented in this thesis had 2 main goals: (1) understand the mechanism by which TOP2 inhibitors generate their lesions in the DNA and their influence of NER, more specifically CSB protein, in response to these lesions to mediate Double Strand Breaks (DSBs) in the DNA; and (2) apply a chemotherapy protocol using a TOP2 inhibitor similar to what is used in clinical practice and evaluate the long-term response of these cells, as well as analyze NER-genes expression at different time- points in this protocol. We present here a review that addresses the role of DNA repair pathways, focusing more on NER, in response to TOP2 inhibitors; besides that, the other works developed during the thesis demonstrate a physical interaction of CSB and TOP2 in response to treatments with TOP2 inhibitors, found by co-immunoprecipitation. In addition, we found that the absence of TOP2 by siRNA, but not its pharmacological inhibition, favors the accumulation of structures such as R-loops, DNA:RNA hybrids that cause genomic instability, but we could not relate the presence of CSB in this context. Regarding the application of the clinical protocol in breast tumor cells, we observed that the proliferation of the treated cells was greatly reduced throughout the protocol used, a combination of Doxorubicin (DOX) and Paclitaxel (PCTX). However, when cells were monitored at the end of DOX cycles, or at the end of the complete protocol, both situations demonstrated that the remaining cells had the potential to resume their growth. Nevertheless, in general we can conclude that at a long-term analysis, the protocol used presented a good efficiency in controlling this proliferation. When analyzing the expression levels of different NER genes after 1 or 4 DOX cycles we found a higher expression of XPA, XPC, ERCC6 and ERCC4 genes, as well as of MRE11, involved in the repair of DSBs, in relation to untreated cells

Influência de mecanismos de resposta a danos no DNA na resistência de células de leucemia ao antineoplásico Mitoxantrona

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2.Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone

Influência de mecanismos de resposta a danos no DNA na resistência de células de leucemia ao antineoplásico Mitoxantrona

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2.Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone