Modificaciones epigenéticas en clonación porcina

The somatic cells nuclear transfer technique (SCNT) or animal cloning, involves transferring the nucleus of a somatic donor cell into the cytoplasm of an oocyte that has been previously removed its nucleus, in order to obtain the necessary machinery to generate an embryo. However, it is a highly inefficient method and requires technical improvements.\nCloning has various applications in animal production. However, is still not entirely clear the mechanisms of nuclear remodeling and reprogramming that must suffer to become an embryo. A variety of factors probably contribute to this inefficiency, from the quality of oocytes to the type of donor cell. The failure to adequately reprogram the transplanted nucleus could be due to a deficient imprinting in somatic nuclei reconstituted embryo. To resolve the reprogramming failures we utilized in embryos the embryo aggregation technique and applied drugs that modify the epigenetic.\nAt the beginning of this study, partenogenetics embryos were used with these drugs that induce changes in methylation and histone acetylation, obtaining a combination of drugs (1 uM 5 Azacitidine + 1 uM PD0325901) which showed a tendency to increase in vitro embryo development. Subsequently, we continued to perform embryo aggregation, generating two groups: (1x) control and (3x) aggregates. The aggregated embryos increased in vitro development rates not involving a greater use of oocytes, also increased size measured by embryonic diameter, however, no statistically differences were found in the number of cells, apoptosis cell or DNA fragmentation between both groups.\nWhen we worked in swine clones, embryo aggregation in the one cell stage showed that were not required additional oocytes to produce higher rates of blastocyst resulting in an increase in the diameter and number of embryonic cells, while the level apoptosis was statistically lower in 3x aggregates embryos . This could prove partial compensation possibly caused by the combination of three different epigenetically embryos that had higher pluripotency gene expression . Moreover, by improving in vitro development, number of cells, embryonic diameter and decrease levels of apoptosis was improving embryonic reprogramming, obtaining better quality embryos.\nIn the last chapter of this thesis, we combined the embryo aggregation method and the use of drugs that induce epigenetic modifications in the early embryo development. This was encompass several aspects involving nuclear reprogramming, gene expression, showing marks relative to histones and DNA methylation. As a result, the treated 3x group showed an increase in embryonic size without involving changes in cell number. Also it showed an increase in gene expression related to trophoblast, involved in embryonic placentation, as in antiapoptotic genes and in the MAPK pathway genes involved.\nAnother change was displayed in the redistribution of acetylated histone H3 lysine 27 (H3K27ac). This is preferably located in the nuclear perisferia. Histone H3 with a methyl group at lysine 4 (H3K4me1) did not modify their distribution within the core, showing a homogeneous distribution. Regarding DNA methylation, Oct4 and Dnmt1 presented a marked demethylation, showing that the drug 5 Azacitidine, acting on methylation, generated changes in the embryos.\nIn conclusion, this work generated a contribution to the study of embryonic reprogramming that must suffer embryos during cloning, covering different variables that affect the reprogramming process.Fil: Buemo, Carla Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLa técnica de transferencia de células somáticas (SCNT) o clonación animal, consiste en transferir el núcleo de una célula somática donante dentro del citoplasma de un ovocito al que se le ha eliminado previamente su núcleo, con el objetivo de obtener la maquinaria necesaria para generar un embrión. Sin embargo, es una técnica altamente ineficiente y requiere de mejoras.\nLa clonación tiene diversas aplicaciones en producción animal. No obstante, siguen sin estar del todo claro los mecanismos de remodelación y reprogramación nuclear que debe sufrir el embrión para que llegue a ser viable. Una variedad de factores probablemente contribuyen a esta ineficiencia, desde la calidad de los oocitos hasta el tipo de célula donante. El fracaso para reprogramar el núcleo trasplantado adecuadamente podría deberse a la deficiente impronta somática en los núcleos del embrión reconstituído. Para resolver las fallas en la reprogramación se recurrió a la técnica de agregación embrionaria y al uso de drogas modificadoras de la epigenética embrionaria.\nAl principio del trabajo se utilizó embriones partenogénicos, en ellos se probaron fármacos que inducen modificaciones en la metilación y la acetilación de histonas, obteniendose una combinación de drogas (5 Azacitidina 1?M + PD0325901 1 ?M ) que demostró una tendencia a aumentar el desarrollo embrionario in vitro. Posteriormente se prosiguió a realizar la agregación embrionaria, generándose dos grupos: el control (1x) y los agregados (3x), en los que tres embriones reconstituídos formaban parte del mismo embrión. En los embriones agregados aumentaron las tasas de desarrollo in vitro no implicando un mayor uso de oocitos, se incrementó el tamaño medido en diámetro embrionario, sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticas significativas en el número de células ni en la apoptosis celular o fragmentación del ADN entre ambos grupos.\nCuando se pasó a trabajar en los clones porcinos, la agregación embrionaria en la fase de una célula demostró que no fueron necesarios oocitos adicionales para producir mayores tasas de blastocistos obteniendose un aumento en el diámetro y en el número de células embrionarias, mientras que el nivel de apoptosis fue estadísticamente más bajo en los embriones agregados 3x. Ésto podría demostrar una compensación parcial causada posiblemente por la combinación de tres embriones epigenéticamente diferentes que presentaban una mayor expresión de genes de pluripotencia. Por otra parte, al mejorar desarrollo in vitro, número de células, el diámetro embrionario y disminuir los niveles de apoptosis se estaba mejorando la reprogramación embrionaria, obteniendose embriones de mejor calidad.\nEn el último capítulo de la tesis se combinó el método de agregación embrionaria y los fármacos inductores de modificaciones epigenéticas en el embrión temprano. Se trató de abarcar varios aspectos que involucran la reprogramación nuclear mostrando expresión génica en relación a marcas de histonas y a metilación del ADN. Como resultado, el grupo 3x tratado con las drogas presentó un aumento en el tamaño embrionario, sin implicar cambios en el número celular. También presentó un incremento en la expresión génica en genes claves para el desarrollo de trofoblasto, implicados en la placentación embrionaria, al igual que en genes antiapoptóticos y genes implicados en la vía MAPK. Otro de los cambios visualizados fue la redistribución de la histona H3 acetilada en la lisina 27 (H3K27ac). Ésta se ubicó preferentemente en la perisferia nuclear. La histona H3 con un grupo metilo en la lisina 4 (H3K4me1) no modificó su distribución dentro del núcleo, mostrando una distribución homogénea. Respecto a la metilación del ADN tanto el gen que codifica para Oct4 como el que codifica para la enzima Dnmt1 presentaron una desmetilación marcada, mostrando que la droga 5 Azacitidina, que actúa sobre la metilación, estaba generando cambios en los embriones estudiados.\nComo conclusión, éste trabajo generó un aporte al estudio de la reprogramación embrionaria que deben sufrir los embriones provenientes de clonación, abarcando distintas variables que afectan el proceso de reprogramación

Tiger, Bengal and Domestic Cat Embryos Produced by Homospecific and Interspecific Zona-Free Nuclear Transfer

The aim of this study was to evaluate three different cloning strategies in the domestic cat (Felis silvestris) and to use the most efficient to generate wild felid embryos by interspecific cloning (iSCNT) using Bengal (a hybrid formed by the cross of Felis silvestris and Prionailurus bengalensis) and tiger (Panthera tigris) donor cells. In experiment 1, zona-free (ZP-free) cloning resulted in higher fusion and expanded blastocyst rates with respect to zona included cloning techniques that involved fusion or injection of the donor cell. In experiment 2, ZP-free iSCNT and embryo aggregation (2X) were assessed. Division velocity and blastocyst rates were increased by embryo aggregation in the three species. Despite fewer tiger embryos than Bengal and cat embryos reached the blastocyst stage, Tiger 2X group increased the percentage of blastocysts with respect to Tiger 1X group (3.2% vs 12.1%, respectively). Moreover, blastocyst cell number was almost duplicated in aggregated embryos with respect to non-aggregated ones within Bengal and tiger groups (278.3 61.9 vs 516.8 103.6 for Bengal 1X and Bengal 2X groups, respectively; 41 vs 220 60 for Tiger 1X and Tiger 2X groups, respectively). OCT4 analysis also revealed that tiger blastocysts had higher proportion of OCT4-positive cells with respect to Bengal blastocysts and cat intracytoplasmic sperm injection blastocysts. In conclusion, ZP-free cloning has improved the quality of cat embryos with respect to the other cloning techniques evaluated and was successfully applied in iSCNT complemented with embryo aggregation.Fil: Moro, L. N.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Jarazo, J. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Buemo, Carla Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Hiriart, María Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Sestelo, A.. Jardín Botánico de Buenos Aires; ArgentinaFil: Salamone, Daniel Felipe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Embryo aggregation does not improve the development of interspecies somatic cell nuclear transfer embryos in the horse

The low efficiency of interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) makes it necessary to investigate new strategies to improve embryonic developmental competence. Embryo aggregation has been successfully applied to improve cloning efficiency in mammals, but it remains unclear whether it could also be beneficial for iSCNT. In this study, we first compared the effect of embryo aggregation over in vitro development and blastocyst quality of porcine, bovine, and feline zona-free (ZF) parthenogenetic (PA) embryos to test the effects of embryo aggregation on species that were later used as enucleated oocytes donors in our iSCNT study. We then assessed whether embryo aggregation could improve the in vitro development of ZF equine iSCNT embryos after reconstruction with porcine, bovine, and feline ooplasm. Bovine- and porcine-aggregated PA blastocysts had significantly larger diameters compared with nonaggregated embryos. On the other hand, feline- and bovine-aggregated PA embryos had higher blastocyst cell number. Embryo aggregation of equine-equine SCNT was found to be beneficial for embryo development as we have previously reported, but the aggregation of three ZF reconstructed embryos did not improve embryo developmental rates on iSCNT. In vitro embryo development of nonaggregated iSCNT was predominantly arrested around the stage when transcriptional activation of the embryonic genome is reported to start on the embryo of the donor species. Nevertheless, independent of embryo aggregation, equine blastocyst-like structures could be obtained in our study using domestic feline-enucleated oocytes. Taken together, these results reported that embryo aggregation enhance in vitro PA embryo development and embryo quality but effects vary depending on the species. Embryo aggregation also improves, as expected, the in vitro embryo development of equine-equine SCNT embryos; however, we did not observe positive effects on equine iSCNT embryo development. Among oocytes from domestic animals tested in our study, the feline ooplasm might be the most appropriate recipient to partially allow preimplantation embryo development of iSCNT equine embryos.Fil: Gambini, Andres. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: de Stefano, Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Jarazo, Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Buemo, Carla Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Karlanian, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Salamone, Daniel Felipe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Embryo Aggregation in Pig Improves Cloning Efficiency and Embryo Quality.

In this study, we analyzed the effects of the cloned embryo aggregation on in vitro embryo development and embryo quality by measuring blastocyst diameter and cell number, DNA fragmentation levels and the expression of genes associated with pluripotency, apoptosis, trophoblast and DNA methylation in the porcine. Zona-free reconstructed cloned embryos were cultured in the well of the well system, placing one (1x non aggregated group) or three (3x group) embryos per microwell. Our results showed that aggregation of three embryos increased blastocyst formation rate and blastocyst diameter of cloned pig embryos. DNA fragmentation levels in 3x aggregated cloned blastocysts were significantly decreased compared to 1x blastocysts. Levels of Oct4, Klf4, Igf2, Bax and Dnmt 1 transcripts were significantly higher in aggregated embryos, whereas Nanog levels were not affected. Transcripts of Cdx2 and Bcl-xl were essentially non-detectable. Our study suggests that embryo aggregation in the porcine may be beneficial for cloned embryo development and embryo quality, through a reduction in apoptotic levels and an improvement in cell reprogramming

Cheetah interspecific SCNT followed by embryo aggregation improves in vitro development but not pluripotent gene expression

The aim of this study was to evaluate the capacity of domestic cat (Dc, Felis silvestris) oocytes to reprogram the nucleus of cheetah (Ch, Acinonyx jubatus) cells by interspecies SCNT (iSCNT), by using embryo aggregation. Dc oocytes were in vitro matured and subjected to zona pellucida free (ZP-free) SCNT or iSCNT, depending on whether the nucleus donor cell was of Dc or Ch respectively. ZP-free reconstructed embryos were then cultured in microwells individually (Dc1X and Ch1X groups) or in couples (Dc2X and Ch2X groups). Embryo aggregation improved in vitro development obtaining 27.4, 47.7, 16.7 and 28.3% of blastocyst rates in the Dc1X, Dc2X, Ch1X and Ch2X groups, respectively (P<0.05). Moreover, aggregation improved the morphological quality of blastocysts from the Dc2X over the Dc1X group. Gene expression analysis revealed that Ch1X and Ch2X blastocysts had significantly lower relative expression of OCT4, CDX2 and NANOG than the Dc1X, Dc2X and IVF control groups. The OCT4, NANOG, SOX2 and CDX2 genes were overexpressed in Dc1X blastocysts, but the relative expression of these four genes decreased in the Dc2X, reaching similar relative levels to those of Dc IVF blastocysts. In conclusion, Ch blastocysts were produced using Dc oocytes, but with lower relative expression of pluripotent and trophoblastic genes, indicating that nuclear reprogramming could be still incomplete. Despite this, embryo aggregation improved the development of Ch and Dc embryos, and normalized Dc gene expression, which suggests that this strategy could improve full-term developmental efficiency of cat and feline iSCNT embryos.Fil: Moro, Lucía Natalia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Hiriart, María Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Buemo, Carla Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Jarazo, J.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Sestelo, A.. Jardín Zoológico de Buenos Aires; ArgentinaFil: Veraguas, D.. Universidad de Concepción; ChileFil: Rodríguez Alvarez, L.. Universidad de Concepción; ChileFil: Salamone, Daniel Felipe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentin

Vesicles Cytoplasmic Injection: An Efficient Technique to Produce Porcine Transgene-Expressing Embryos

The use of vesicles co-incubated with plasmids showed to improve the efficiency of cytoplasmic injection of transgenes in cattle. Here, this technique was tested as a simplified alternative for transgenes delivery in porcine zygotes. To this aim, cytoplasmic injection of the plasmid alone was compared to the injection with plasmids co-incubated with vesicles both in diploid parthenogenic and IVF zygotes. The plasmid pcx-egfp was injected circular (CP) at 3, 30 and 300 ng/μl and linear (LP) at 30 ng/μl. The experimental groups using parthenogenetic zygotes were as follows: CP naked at 3 ng/μl (N = 105), 30 ng/μl (N = 95) and 300 ng/μl (N = 65); Sham (N = 105); control not injected (N = 223); LP naked at 30 ng/μl (N = 78); LP vesicles (N = 115) and Sham vesicles (N = 59). For IVF zygotes: LP naked (N = 44) LP vesicles (N = 94), Sham (N = 59) and control (N = 79). Cleavage, blastocyst and GFP+ rates were analysed by Fisher's test (p < 0.05). The parthenogenic CP naked group showed lower cleavage respect to control (p < 0.05). The highest concentration of plasmids to allow development to blastocyst stage was 30 ng/μl. There were no differences in DNA fragmentation between groups. The parthenogenic LP naked group resulted in high GFP rates (46%) and also allowed the production of GFP blastocysts (33%). The cytoplasmic injection with LP vesicles into parthenogenic zygotes allowed 100% GFP blastocysts. Injected IVF showed higher cleavage rates than control (p < 0.05). In IVF zygotes, only the use of vesicles produced GFP blastocysts. The use of vesicles co-incubated with plasmids improves the transgene expression efficiency for cytoplasmic injection in porcine zygotes and constitutes a simple technique for easy delivery of plasmids.Fil: Luchetti, Carolina Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Bevacqua, Romina Jimena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Lorenzo, María Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Tello, Maria Fernanda. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Willis, Miguel Alfredo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; ArgentinaFil: Buemo, Carla Paola. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; ArgentinaFil: Lombardo, Daniel Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; ArgentinaFil: Salamone, Daniel Felipe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Pabellón de Zootecnica. Laboratorio de Biotecnología Animal; Argentin

Blastocyst number of cells of cloned aggregated and non-aggregated embryos at day 7.

<p>Nuclei were counterstained with 30μg/mL propidium iodide (P4170) for 10 min in the dark.</p

Manual de bioseguridad y buena conducta en el laboratorio

Gran parte de las actividades que desarrolla el Grupo de Investigación en Genética Aplicada (GIGA), poseen algún grado de riesgo para la salud de los investigadores, becarios, docentes, alumnos y usuarios en general del GIGA.Es por ello que este manual reúne la mayoría de las indicaciones de la Ley Nacional de Higiene y Seguridad en el Trabajo Nº 19.587/72, su Decreto Reglamentario Nº 351/79 y el Decreto 1338/96. Relacionada a esta legislación tenemos la Ley Nº 24.051/92 de Residuos Peligrosos y su Decreto Reglamentario 831/93; la Ley Nº 24.557 de Riesgos del Trabajo las Leyes del Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires Nº 154/99 de Residuos Patogénicos con su Dec. Reg. 1886/01 y la Ley 2014/06 de Residuos Peligrosos con su Dec. Reg. 2.020/07 y las recomendaciones técnicas necesarias para minimizar los riesgos existentes por acciones inseguras y llevar a cabo un trabajo seguro y eficiente en el laboratorio.Este Manual está dirigido a investigadores, becarios de Grado y Post Grado y usuarios en general de las instalaciones del GIGA y por tanto debe ser conocido por todos los funcionarios profesionales, técnicos y administrativos relacionados con el trabajo en el laboratorio.Fil: Ferreras, Julian Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas | Universidad Nacional de Misiones. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas; Argentina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; ArgentinaFil: Buemo, Carla Paola. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas | Universidad Nacional de Misiones. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas; ArgentinaFil: del Pozo, Marcela Roxana. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales; Argentina. Universidad Nacional de Misiones; ArgentinaFil: Kuhlmann, Pamela Angelique. Universidad Nacional de Misiones; Argentina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales; ArgentinaFil: Argüelles, Carina Francisca. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; ArgentinaFil: Uribe Cruz, Carolina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales; Argentina. Universidad Nacional de Misiones; ArgentinaFil: Rodriguez, Maria Betiana. Universidad Nacional de Misiones; Argentina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales; ArgentinaFil: Miretti, Marcos Mateo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas | Universidad Nacional de Misiones. Instituto de Biología Subtropical. Instituto de Biología Subtropical - Nodo Posadas; Argentina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales; ArgentinaFil: Depasquino, Anibal Fernando. Universidad Nacional de Misiones; Argentina. Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales; Argentin

Primers sequences and conditions for RT-qPCR.

<p>Primers sequences and conditions for RT-qPCR.</p

Index of apoptosis of aggregated and non-aggregated pig cloned blastocyst, showing statistically differences (p<0.05, T-Student test).

<p>Index of apoptosis of aggregated and non-aggregated pig cloned blastocyst, showing statistically differences (p<0.05, T-Student test).</p