Selection of okra parents based on performance and genetic divergence

A total of 200 okra accessions with wide variability and a potential for genetic improvement were stored in the Vegetables Germplasm Bank of the Federal University of Viçosa (UFV-BGH) in Viçosa, Minas Gerais State, Brazil. The objective of this work was to select parents by genetic divergence and behavior per se in 70 okra accessions from the BGH-UFV by quantitative and qualitative descriptors of economic interest. Analysis of individual and combined variance, by clustering of means by Scott-Knott test, of the accessions by Tocher’s method and selection based on qualitative descriptors and behavior per se using the methodology of sum of inverted positions was made. The variability of the characteristics of the accessions as verified by the Scott-Knott test formed different groups and subgroups by Tocher’s method. Fifteen accessions were selected with the qualitative descriptors, and based on the sum of inverted positions for quantitative descriptors the BGH-132, BGH-547, BGH-693, BGH-740, BGH-961, BGH-7863, BGH- 7865, BGH-3196 and BGH-4890 okra accessions were selected as potential parents.Key words: Abelmoschus esculentus (L.) Moench, germplasm bank, genetic resource, genetic improvement

Potencial de hibridação entre acessos de tomateiro para pré‑melhoramento quanto à resistência à requeima

The objective of this work was to evaluate parents with hybridization potential for pre‑breeding of tomato (Solanum lycopersicum) for resistance to late blight. Six tomato accessions (BGH‑2102, BGH‑2117, BGH‑2127, BGH‑2130, BGH‑2332, and BGH‑2343) were used as resistant parents and 15 F1 hybrids originated from these parents. The design was a randomized complete block with three replicates. The plants were inoculated with a mixture of Phytophthora infestans sporangia, the etiological agent oflate blight, at a concentration of 5x103 sporangia mL‑1. The area under the disease progress curve was used to evaluate resistance. Diallelic analysis was performed, considering the effect of genotypes as fixed. The general and specific combining ability of the accessions was estimated. The resistance pattern of the parents and of most of the F1 was the same as that of the resistant controls. The following were observed: additive genetic variability among the parents, predominance of nonadditive gene effects, and bidirectional dominance deviations in the control of the trait. The frequency of favorable and divergent alleles for late blight resistance is higher in the BGH‑2117, BGH‑2127, and BGH‑2343 accessions.O objetivo deste trabalho foi avaliar genitores com potencial de hibridação para o pré‑melhoramento do tomateiro (Solanum lycopersicum) quanto à resistência à requeima. Foram utilizados seis acessos de tomateiro (BGH‑2102, BGH‑2117, BGH‑2127, BGH‑2130, BGH‑2332 e BGH‑2343) como genitores resistentes e 15 híbridos F1 originários destes genitores. Utilizou-se o delineamento de blocos ao acaso, com três repetições. As plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de Phytophthora infestans, agente etiológico da requeima, na concentração de 5x103 esporângios mL‑1. A área abaixo da curva de progresso da doença foi utilizada para avaliar a resistência. Realizou-se a análise dialélica, tendo-se considerado o efeito de genótipos como fixo. Estimou-se a capacidade geral e específica de combinação dos acessos. O padrão de resistência dos genitores e da maioria dos F1 foi o mesmo que o das testemunhas resistentes. Foram observados: variabilidade genética aditiva entre os genitores, predominância de efeitos gênicos não aditivos e desvios de dominância bidirecional no controle do caráter. A frequência de alelos favoráveis e divergentes para resistência à requeima é maior nos acessos BGH‑2117, BGH‑2127 e BGH‑2343

Identification of the begomovirus resistance genes Ty‑2 and Ty‑3 in tomato genotypes

O  objetivo  deste  trabalho foi  identificar  a  presença  dos genes  Ty‑2 e Ty‑3, de resistência a begomovírus, em acessos de tomateiro do Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa. Os oligonucleotídeos TO302 F/R e FLUW25 F/R foram utilizados em reações de PCR, para verificar a presença de marcadores relacionados aos genes Ty‑2 e Ty‑3, respectivamente. Observou-se a presença do gene Ty‑2, em heterozigose na subamostra BGH-6881 (Solanum peruvianum), e do gene Ty‑3, em homozigose nas subamostras BGH-6878, BGH-6897 (S. lycopersicum)  e  em heterozigose  na subamostra BGH-6881. A identificação dos genes de resistência, com reações de PCR, representa um avanço para os programas de melhoramento de tomateiro no Brasil.The objective of this work was to identify the presence of the genes begomovirus resistence Ty‑2 and Ty‑3 in tomato accessions of the Banco de Germoplasma de Hortaliças of the Universidade Federal de Viçosa. The oligonucleotides TO302 F/R and FLUW25 F/R were used in PCR analysis to verify the presence of markers associated to the genes Ty‑2 and Ty‑3, respectively. The Ty‑2 gene was observed in heterozygosis in the accession BGH-6881 (Solanum peruvianum), and the Ty‑3 gene in homozygosis in the accessions BGH-6878, BGH-6897 (S. lycopersicum), and in heterozygosis in acession BGH-6881. The identification of resistance genes, using PCR analysis, represents an advance for tomato breeding programs in Brazil

Pre-breeding for resistance to late blight in tomato

A tomaticultura é considerada uma atividade de elevado risco econômico e grande complexidade agronômica, principalmente pelo elevado número de patógenos que causam doenças na cultura. Entre os patógenos de maior importância, destaca-se o oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, causador da requeima ou mela, considerada a doença mais destrutiva do tomateiro. Não existem cultivares comerciais de tomate resistentes, e o controle da doença é altamente dependente do uso de fungicidas de caráter preventivo e/ou curativo. Considerando que o tomateiro é uma das plantas cultivadas mais bem estudadas em termos genéticos, a inexistência de cultivares resistentes no mercado reflete a dificuldade em se trabalhar essa característica nos programas de melhoramento. Os objetivos com o presente estudo foram selecionar fontes de resistência à requeima entre acessos de Solanum lycopersicum, e estimar as capacidades geral e específica de combinação dos acessos de S. lycopersicum selecionados quanto a resistência à requeima, visando selecionar potenciais genitores para o pré-melhoramento da resistência a esta doença. Foram realizados dois experimentos. No primeiro avaliou-se doze acessos de S. lycopersicum, do Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa BGH UFV (BGH- 973, BGH-1025, BGH-2017, BGH-2093, BGH-2095, BGH-2102, BGH-2117, BGH- 2127, BGH-2130, BGH-2332, BGH-2333 e BGH-2343) no delineamento em blocos casualizados, com três repetições. Para a avaliação da resistência, as plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de P. infestans, na concentração de 5x103 esporângios mL-1, coletados em diferentes regiões da Zona da Mata Mineira. Avaliou-se a porcentagem do tecido vegetal afetado pela doença, ou seja, a porcentagem de severidade, avaliada sob a forma de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Os acessos BGH-2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH-2332 e BGH-2343 obtiveram valores médios de AACPD inferiores aos das testemunhas resistentes, sendo selecionados como fonte de resistência à requeima. Os acessos selecionados como resistentes à requeima foram utilizados em um segundo experimento, onde foi realizado um dialelo balanceado de meia tabela, e obtidos quinze híbridos F1 s. Os seis acessos de S. lycopersicum, BGH-2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH-2332 e BGH-2343 juntamente com os quinze híbridos F1 s foram avaliados em delineamento em blocos casualizados, com três repetições. Para a avaliação da resistência, as plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de P. infestans, na concentração de 5x103 esporângios mL-1, coletados em diferentes regiões da Zona da Mata Mineira. Avaliou-se a porcentagem do tecido vegetal afetado pela doença, ou seja, a porcentagem de severidade, avaliada sob a forma de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Procedeu-se a análise dialélica de acordo com o modelo de GRIFFING (1956). Observou-se existência de variabilidade genética aditiva entre os genitores e predominância de efeitos gênicos aditivos envolvidos na determinação da AACPD, além da existência de desvios de dominância bidirecional no controle do caráter em questão. A análise dialélica foi eficiente na seleção de genitores visando o pré-melhoramento da resistência à requeima, destacando os acessos BGH- 2117, BGH-2127 e BGH-2343 como os de maior frequência de alelos favoráveis e divergentes, por isso devem ser incluídos em cruzamentos visando o pré-melhoramento da resistência à requeima.The tomato production is considered a high risk economic activity, and of great agronomic complexity mainly because of the high number of pathogens that causes diseases in the culture. Among the pathogens of greatest importance, there is the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, causing late blight, which is considered the most destructive disease of tomato. There are no commercial tomato cultivars resistant and the control of this disease is highly dependent on the use of fungicides. Considering that the tomato is one of the most studied crop in genetic terms, the lack of resistant cultivars in the market reflects the difficulty in working this trait in breeding programs. The objectives with this present study was to select sources of resistance to late blight among accessions of Solanum lycopersicum, and estimate the overall and specific ability of combining six tomato accessions of Solanum lycopersicum selected for resistance to late blight, aiming at the selection of potential genitors for pre-breeding for resistance to this disease. Two experiments were carried out. In the first, twelve accessions of S. lycopersicum, from the Vegetable Germplasm Bank of the Federal University of Viçosa - BGH - UFV (BGH-973, BGH-1025, BGH- 2017, BGH-2093, BGH-2095, BGH-2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH- 2332, BGH-2333 and BGH-2343) were evaluated in a randomized block design with three replications. For the evaluation of the resistance, the plants were inoculated with a mixture of sporangia of P. infestans, in the concentration of 5x103 sporangia mL-1 , collected in different regions of the Zona da Mata Mineira. It was evaluated the percentage of plant tissue affected by the disease, or the percentage of severity, evaluated in the form of area under the disease progress curve (AUDPC). The accessions BGH-2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH-2332 and BGH-2343 obtained average values of AUDPC lower than the resistant controls, and were selected as a source of resistance to late blight. The selected accessions as resistant to late blight were used in a second experiment, where a balanced diallel of half table were realized, and fifteen F1 s hybrids were obtained. The six accessions of S. lycopersicum, BGH- 2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH-2332 and BGH-2343 together with the fifteen F1 s hybrid were evaluated in a randomized block design with three replications. For the evaluation of the resistance, the plants were inoculated with a mixture of sporangia of P. infestans, in the concentration of 5x103 sporangia mL-1 collected in different regions of the Zona da Mata Mineira. The percentage of plant tissue affected by the disease, or the percentage of severity, presented in the form of area under the disease progress curve (AUDPC) were evaluated. The diallelic analysis was carried out according to the model of GRIFFING (1956). Observed existence of additive genetic variability between the genitors and the predominance of additive gene effects involved in determining the AUDPC, besides the existence of bidirectional dominance deviations in the control of the character. The diallel analysis was efficient in selecting genitors aimed at a pre-breeding of resistance to late blight, highlighting the accessions BGH- 2117, BGH-2127 and BGH-2343 with the greatest frequency of favorable alleles and divergent, thus they can be included in crossings aiming the pre-breeding for resistance to late blight.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

Proteomic analysis of resistance to late blight in tomato

O cultivo do tomateiro possui relevante importância sócio-econômica na agricultura brasileira. Mesmo diante deste cenário favorável, a tomaticultura é considerada uma atividade de elevado risco econômico e de grande complexidade agronômica. Dentre os principais problemas, destaca-se a requeima, causada pelo oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. O controle da doença é altamente dependente do uso de agrotóxicos, pois a maioria dos cultivares de tomateiro não são resistentes. Na tentativa de reverter esse quadro, a principal alternativa é a transferência de genes de resistência presentes em acessos de tomateiro conservados em Bancos de Germoplasma. Assim, após oito anos de pesquisas foi selecionado o acesso BGH-2127 (Solanum lycopersicum), como fontes de resistência a requeima, dentre os 870 acessos de tomateiro do Banco de Germoplama de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa (BGH-UFV). Pelo fato da resistência ser quantitativa, torna-se difícil a avaliação e seleção fenotípica de genótipos superiores, feita apenas no campo ou em associação com marcadores moleculares genéticos tipo QTL. Neste contexto, a metodologia da análise proteômica torna-se uma alternativa viável, pois pode fornecer importantes informações e ferramentas para maior entendimento das rotas metabólicas da interação planta-patógeno e assim auxiliar no desenvolvimento de futuras estratégias para o desenvolvimento de cultivares de tomateiro resistentes. Com o auxílio de ferramentas proteômica, os objetivos deste estudo foram: analisar possíveis diferenças entre os proteomas constitutivos de genótipos de tomateiro contrastantes quanto a resistência à requeima; e identificar proteínas frente a infecção do patógeno que possam explicar possíveis mecanismos moleculares de resistência do tomateiro a esta doença. Foram avaliados o acesso BGH-2127 e o cultivar Santa Clara, resistente e suscetível à requeima, respectivamente. Para avaliação do proteoma constitutivo, as proteínas foram extraídas de amostras das folhas dos genótipos sem que tivesse ocorrido a inoculação, apenas comparando a constituição proteica do BGH-2127 e do Santa Clara. Na avaliação à resposta ao patógeno, as plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de P. infestans, na concentração de 1x10 3 esporângios mL -1 , coletados em regiões da Zona da Mata Mineira, e as proteínas foram extraídas de folhas de cada genótipo inoculado e não inoculado (controle) coletadas nos tempos 0, 2 e 48 horas. Na análise proteômica foi utilizada a técnica da eletroforese bidimensional (2-DE), com a primeira dimensão (focalização isoelétrica) realizada em tiras IPG de 24 cm, pH 3-10, e a segunda dimensão em SDS-PAGE, em gel 12,5%T. Foram obtidos três géis por tratamento, correspondendo a três repetições biológicas. Em seguida, os géis foram revelados por coloração com azul de coomassie coloidal. Posteriormente as imagens dos géis foram digitalizadas usando o equipamento Image Scanner III e analisadas no software ImageMaster 2D Platinum 7.5. Spots com variação de sobreposição acima de 1,5 e ANOVA p<0,05 foram considerados diferencialmente abundantes. Os spots das proteínas diferencialmente abundantes foram identificados em espectrômetro de massas do tipo MALDI-TOF/TOF Ultraflex III. As listas de massas obtidas foram confrontadas contra os bancos de dados de proteínas obtidos do UNIPROT, com auxílio do software MASCOT e os resultados obtidos, validados pelo aplicativo SCAFFOLD com pelo menos 90% de probabilidade. As proteínas identificadas foram categorizadas funcionalmente usando o software Mapman. Uma vez listadas as proteínas diferencialmente abundantes para os genótipos BGH-2127 e Santa Clara foi realizada a construção de uma rede de interação proteína-proteína utilizando o software STRING. Ensaios de PCR em Tempo Real (RT-PCR) foram realizados para confirmar os níveis de abundância de algumas proteínas identificadas. O RNA total foi extraído de amostras de folhas e o cDNA obtido foi quantificado pelo equipamento SpectraMax M5 microplate/cuvette reader. A amplificação dos fragmentos alvo foi realizada utilizando o equipamento StepOneTM Real-Time PCR System e para a quantificação da expressão gênica foi utilizado o software REST. Na avaliação do proteoma constitutivo, 19 proteínas foram identificadas, e estão relacionadas com metabolismo e energia, fotossíntese, estresse e defesa e à transcrição. Aproximadamente 90% destas proteínas foram mais abundantes no cultivar Santa Clara. As proteínas endoquitinase ácida de 26 kDa e ribonuclease T2 foram mais abundantes no BGH-2127. Atividade enzimática confirmou maior abundância de quitinase no acesso BGH-2127 em relação à Santa Clara. Os padrões de expressão avaliados por PCR em tempo real diferiram dos resultados da análise proteômica. Na avaliação da resposta ao patógeno, 56 proteínas diferencialmente abundantes foram identificadas, sendo 39 referentes ao genótipo resistente e 17 ao suscetível. Estas proteínas foram categorizadas em grupos de funções biológicas de energia e metabolismo, fotossíntese, estresse e defesa, transcrição, outras proteínas e não caracterizadas. Para o acesso BGH-2127, proteínas do estresse oxidativo (2-cis peroxirredoxina BAS1 e 2-cis peroxirredoxina) e relacionadas à patogênese da família PR-5 (taumatina) tiveram os níveis de abundancia relativa aumentados nos tempos 0 e 48 horas após a inoculação, respectivamente, e foram consideradas importantes para o mecanismo de defesa deste genótipo. Os padrões de expressão avaliados por PCR em tempo real diferiram dos resultados da análise proteômica. Redes de interações proteína-proteína forneceram importantes informações sobre atividades celulares envolvidas na resistência do BGH-2127 à requeima. Diferenças na abundância das proteínas endoquitinase ácida de 26 kDa e ribonuclease T2 entre os proteomas constitutivos dos genótipos avaliados podem contribuir para o mecanismo de resistência do BGH-2127 à requeima. Proteínas relacionadas ao estresse oxidativo (PR-9) e família taumatina (PR-5) possuem papel importante no mecanismo de defesa do acesso BGH- 2127 resistente a requeima do tomateiro.Growing tomatoes has significant economic and social importance in brazilian agriculture. Nevertheless, the tomato production is considered an activity of high economic risk and major agronomic complexity. Among the main problems with regard to pests and diseases, there is the late blight, caused by the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Disease control is highly dependent on the use of pesticides and there is no resistant cultivars. The main strategy to reverse that one situation is the introgression of resistance genes present in tomato accessions stored in germplasm banks. So, after eight years of research, BGH-2127 access (Solanum lycopersicum) was selected as a source of resistance to late blight, among the 870 tomato accessions of Vegetable Germplasm Bank of the Federal University of Viçosa (BGH-UFV). Due to the resistance to be quantitative it becomes difficult to practice selection of superior genotypes, made only in the field or associated with genetic molecular markers. In this context, the methodology of proteomics becomes viable alternative to provide valuable information and tools to better understanding the different ways of plant-pathogen relationship, thus this methodology can help future proposals genetic strategies to develop resistance cultivars of tomatoes. With the help of proteomic tools, the objectives of this study were: to analyze differences between the constitutive proteomes of tomato genotypes contrasting in resistance to late blight; and identify proteins against infection of the pathogen that may explain possible molecular mechanisms of resistance of tomato to this disease. The BGH-2127 and Santa Clara cultivar, resistant and susceptible to late blight respectively, were evaluated. For the evaluation of the constitutive proteome, proteins were extracted from leaf samples of the genotypes without inoculation, only comparing the protein constitution of BGH-2127 and Santa Clara. In evaluating the response to the pathogen, the plants were inoculated with a mixture of sporangia of P. infestans sporangia at a concentration of 1 x 10 3 sporangia mL −1 from different regions of Zona da Mata. Proteins were extracted from leaves of each genotype inoculated and non-inoculated (control) collected at time 0, 2 and 48 hours. In the proteomic analysis, the two-dimensional electrophoresis technique (2-DE) was used, with the first dimension (isoelectric focusing) performed using a 24-cm strip containing an immobilized pH gradient (IPG) ranging from 3 to 10 and the second dimension was performed on SDS-PAGE 12.5%T. Three gels were obtained by treatment, corresponding to three biological replicates. Then the gels were stained with colloidal coomassie blue. Posteriorly the gels were scanned with the aid of Image Scanner III and analyzed using ImageMaster 2D Platinum 7.0 software. The expression values were considered significant according to the analysis of variance (ANOVA) at p<0.05. Proteins in which the abundance ranged at least 1.5 times were considered to be differentially abundant. Protein identification was performed using the MALDI- TOF/TOF Ultraflex III type mass spectrometer. The standard list of proteins was obtained UNIPROT, through the use of the MASCOT application. The result obtained by MASCOT was validated by the SCAFFOLD application, with a minimum of 90% probability. Identified proteins were functionally categorized using Mapman program. Once the differentially abundant proteins for BGH-2127 and Santa Clara genotypes were listed, the construction of a protein-protein interaction network was carried out using the STRING software. Real-time PCR assays (RT-PCR) were performed to confirm the levels of abundance of some identified proteins. Total RNA was extracted from leaf samples and the cDNA obtained was quantified by the SpectraMax M5 microplate/cuvette reader. The PCR reaction was performed using StepOneTM Real- Time PCR System. Quantification of gene expression was performed using REST software. In evaluation of the constitutive proteome, nineteen proteins were identified, which were then related to metabolism and energy, photosynthesis, transcription, stress and defenses. Approximately 90% of these proteins were more abundant in Santa Clara, a susceptible cultivar. Acidic 26 kDa endochitinase and ribonuclease T2 proteins were more abundant in BGH-2127 access. The enzymatic activity confirmed a greater abundance of chitinase in the BGH-2127 access as compared to the cultivar Santa Clara. Gene expression analyses by real time PCR demonstrated that the mRNA levels were not correlated with the respective protein levels. Abundance of the acidic 26 kDa endochitinase and ribonuclease T2 proteins in the constitutive proteomes of BGH-2127 may be associated with the answer to the resistance of this access. In evaluating the response to the pathogen, fifty-six differentially abundant proteins were identified, with thirty-nine referring to the resistant genotype and seventeen to the susceptible genotype. These proteins were categorized into functional groups of energy and metabolism, photosynthesis, stress and defense, transcription, other proteins and not characterized. For access BGH-2127, oxidative stress proteins (2-cis peroxiedoxin BAS1 and 2-cis peroxiredoxin) and thaumatin-like protein had levels of relative abundance increased at times 0 and 48 hours after respectively, and were considered important for the defense mechanism of this genotype. The expression standards evaluated by RT-PCR differed from the results of the proteomic analysis. Protein-protein interaction networks provided important information on cellular activities involved in the resistance of BGH-2127 late blight. Abundance of the acidic 26 kDa endochitinase and ribonuclease T2 proteins in the constitutive proteomes of BGH-2127 may be associated with the answer to the resistance of this access. Proteins related to oxidative stress (PR-9) and thaumatin-like family (PR-5) play an important role in the BGH-2127 access defense mechanism resistant to tomato late blight.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic