Aislamiento, purificación y caracterización de las proteasas de frutos de Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae)

Objetivos de la investigación: - Aislar, purificar y caracterizar peptidasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi Mez, especie vegetal que crece espontáneamente en el Noroeste de nuestro país. - Contar con nuevas fuentes de enzimas proteolíticas que eventualmente reemplacen a las preparaciones comerciales importadas que actualmente se usan en diversos procesos biotecnológicos.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Implementación de nuevas prácticas pedagógico-didácticas en la asignatura Biología para incrementar el aprendizaje de los alumnos

La estructura pedagógico-didáctica de la asignatura Biología del CIBEX (Ciclo Básico de Exactas) de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP ha variado en los últimos años, estableciéndose un cambio significativo en 2011 cuando se sustituyeron las clases teóricas y de seminario por la modalidad taller. Esta nueva forma de trabajo implicó cambios organizativos entre los que se pueden citar la modificación del rol de los docentes y su posicionamiento en el aula, el recorte de contenidos para adaptarlos al tiempo disponible, la confección de una nueva guía de actividades para los alumnos, la selección del material bibliográfico y por último cambios en el tipo de evaluación, en concordancia con el nuevo esquema de dictado de la asignatura. La nueva modalidad tuvo un efecto positivo, lográndose una actitud más participativa, crítica y activa por parte de algunos alumnos, en comparación con lo observado con la modalidad de enseñanza anterior. Sin embargo, el cambio también abrió una ventana a la detección de problemas en los procesos de enseñanza y aprendizaje que antes no eran evidentes, además de mostrar falencias relacionadas con la implementación de la nueva modalidad. Por lo tanto la idea del presente trabajo es que a partir de la visualización e identificación de las mencionadas situaciones problemáticas se planifique una estrategia integral que involucre determinados cambios en la forma de enseñar esta asignatura para mejorar el rendimiento en el aprendizaje de los estudiantes.Facultad de Ciencias Exacta

Obtención, caracterización y encapsulamiento de peptidasas de Bromelia hieronymi Mez y Bromelia serra Grieb (Bromeliaceae) para uso industrial

Se obtuvieron cinco extractos crudos a partir de frutos y ejes de Bromelia hieronymi Mez y tres a partir de frutos de B. serra Griseb. (Bromeliaceae). Se determinó la presencia de actividad proteolítica sobre caseína, presentando 5,7±0,3 y 1,8±0,8 Ucas/mg los extractos de frutos inmaduros de B. hieronymi y frutos maduros de B. serra, respectivamente. Este último presentó la mayor actividad antioxidante correspondiente a 4,92±0,03 mg/ml de Trólox. El perfil proteico fue analizado por isolectroenfoque, detectándose seis bandas para B. hieronymi y cuatro para B. serra. Por SDS-PAGE se observó la presencia en todos los extractos de fruto de una banda de alrededor de 25 kDa, típica de las peptidasas cisteínicas de plantas. Por otra parte, se iniciaron estudios de encapsulamiento en almidón de mandioca (Manihot esculenta) empleando el extracto concentrado de B. hieronymi, que presentó la mayor actividad por unidad de volumen (10,5±0,3 Ucas/ml), recuperándose un porcentaje significativo de la actividad original. Estos extractos, obtenidos a partir de recursos autóctonos, serían promisorios como fuente de peptidasas para uso industrial. La posibilidad de encapsular estas enzimas en matrices biopoliméricas podría permitir su empleo en tecnología de alimentos.Facultad de Ciencias Exacta

Characterization of the fruit proteolytic system of Bromelia serra Griseb. (Bromeliaceae) and its application in bioactive peptides release

A crude extract with proteolytic activity was prepared from edible fruits of Bromelia serra, containing cysteine peptidases with molecular masses between 24.1 and 25.9 kDa. The extract presented an optimal pH range of 6.03‒9.05, retained more than 80% of activity after thermal pre-treatments at 23, 37, and 45°C (120 min), but it was rapidly inactivated after 10 min at 75°C. These proteases were employed to hydrolyze soybean proteins, bovine casein and bovine whey, achieving degrees of hydrolysis of 18.3 ± 0.6, 29.1 ± 0.7, and 12.6 ± 0.9% (55°C, 180 min), respectively. The casein 180 min-hydrolysate (55°C) presented the maximum value of antioxidant activity (2.89 ± 0.12 mg/mL Trolox), and the whey protein 180 min-hydrolysate (55°C) showed the highest percentage of angiotensin-converting enzyme inhibition (91.9 ± 1.2%). This low-cost enzymatic preparation would be promising for the food industry because it requires mild working conditions and yields hydrolysates with biological activities useful as ingredients for functional food. Practical application: Proteolytic enzymes are employed in the food industry in a wide variety of processes since they modify the properties of proteins causing beneficial effects such as improvement digestibility, diminution of allergenicity, and release of bioactive peptides. Fruits from Bromelia serra possess cysteine peptidases that could be used in food biotechnology because they are capable to hydrolyze soybean and milk proteins by mild working conditions and to provoke the release of bioactive peptides. These hydrolysates containing antioxidative and ACE-inhibitor activities would be useful as ingredients for functional foods or as nutraceuticals, which are nowadays two products highly required by consumers.Fil: Salese, Lucía. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Liggieri, Constanza Silvina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; ArgentinaFil: Bernik, Delia Leticia. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Bruno, Mariela Anahí. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentin

CARACTERIZACIÓN DE PROTEASAS DE BROMELIAS AUTÓCTONAS Y SU APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE BIOPÉPTIDOS A PARTIR DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS

Numerosas especies vegetales poseen grandes cantidades de proteasas que podrían ser empleadas en biotecnología alimentaria. Nuestro objetivo es obtener, purificar y caracterizar peptidasas de bromelias autóctonas (Bromeliaceae) y emplearlas en la producción de péptidos bioactivos a partir de proteínas alimentarias, con el fin de ser evaluados como posibles componentes en alimentos funcionales y nutracéuticos. Se obtuvieron diferentes extractos crudos (ECs) a partir de frutos inmaduros y ejes de las infrutescencias de Bromelia hieronymi, a partir de frutos de B. serra en diferente estado de madurez o por el empleo de diferentes partes de las bayas y, a partir de hojas de Deinacanthon urbanianum (=B. urbaniana). Los ECs de fruto de B. hieronymi fueron los más activos. El EC de hoja de D. urbanianum presentó baja actividad caseinolítica (AC), sin embargo, muestra al zimograma una banda muy activa de pI alcalino. Respecto a los ECs de B. serra, se seleccionó un extracto de frutos de maduración intermedia por sus valores de AC, con el objetivo de caracterizar y determinar las condiciones óptimas de trabajo. Se determinó que las proteasas de B. serra son de tipo cisteínico, sus masas moleculares están comprendidas entre 23,3-26,6 kDa, y presentan un rango de pH óptimo de 6,3-9,0. Se observó estabilidad térmica por preincubación a 23, 37 y 45 ºC, e inactivación luego de 10 min de tratamiento a 75 ºC o de 2 min a 100 ºC. La mayor actividad esterásica se obtuvo sobre el sustrato N-α-carbobenzoxi-p-nitrofenil éster de L-Ala. Mediante purificación parcial con acetona y etanol se observó que, con cuatro volúmenes de ambos solventes, se recupera más del 90% de AC respecto del EC. Al menos 4 bandas proteicas fueron observadas al IEF (pIs: 8,4-<3,5), siendo la región alcalina la más activa. Se emplearon extractos de B. serra y B. hieronymi para hidrolizar proteínas de lactosuero, caseína y proteínas de soja, a 45 y 55 ºC. En todos los casos se observó una degradación progresiva de los tres sustratos y se obtuvieron mayores porcentajes de grado de hidrólisis en los hidrolizados de caseína de 55 ºC. Los hidrolizados de lactosuero presentaron los valores más altos de inhibición de la ECA. Por otra parte, se determinó la actividad antioxidante mediante dos variantes del método del ABTS (original y “quencher”), mostrando los mayores valores con el método quencher a 55 ºC para los hidrolizados de caseína. Las actividades biológicas fueron más elevadas en los hidrolizados de B. hieronymi por lo que fueron seleccionados para su posterior fraccionamiento por exclusión molecular. Se diseñó un protocolo para encapsular hidrolizados de lactosuero con actividad inhibitoria de la ECA caracterizado por MALDI-TOF. Empleando almidón de mandioca y mediante un procedimiento a bajas temperaturas se generan estructuras resistentes, con el fin de que los péptidos encapsulados no se degraden en la primera porción del tracto gastrointestinal

Hieronymain I, a New Cysteine Peptidase Isolated from Unripe Fruits of <i>Bromelia hieronymi</i> Mez (Bromeliaceae)

A new peptidase, named hieronymain I, was purified to homogeneity from unripe fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae) by acetone fractionation followed by cation exchange chromatography (FPLC) on CM-Sepharose FF. Homogeneity of the enzyme was confirmed by mass spectroscopy (MALDI-TOF), isoelectric focusing, and SDS-PAGE. Hieronymain is a basic peptidase (pI > 9.3) and its molecular mass was 24,066 Da. Maximum proteolytic activity on casein (>90% of maximum activity) was achieved at pH 8.5-9.5. The enzyme was completely inhibited by E-64 and iodoacetic acid and activated by the addition of cysteine; these results strongly suggest that the isolated protease should be included within the cysteine group. The N-terminal sequence of hieronymain (ALPESIDWRAKGAVTEVKRQDG) was compared with 25 plant cysteine proteases that showed more than 50% of identity.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

EMPLEO DE PEPTIDASAS DE Maclura pomifera (RAF.) SCHNEID (MORACEAE) EN LA LIBERACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS CON APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Las proteasas constituyen el 60% de las enzimas del mercado; poseen una gran diversidad estructural y funcional que les permite actuar sobre diversos sustratos. En la industria alimentaria son empleadas en diversos procesos tales como la tiernización de carnes, manufactura de quesos, panificados, cerveza, y la preparación de hidrolizados proteicos. Su acción puede provocar la liberación de péptidos bioactivos, es decir, fragmentos de proteínas específicas que impactan positivamente en el funcionamiento del organismo. Entre las actividades reportadas se encuentran: la acción antimicrobiana, quelante de metales, antioxidante, antitrombótica, antihipertensiva, anticancerígena, hipocolesteroémica e inmunomodulatoria, entre otras. Maclura pomifera es una especie cultivada en nuestro país, cuyos frutos poseen látex rico en peptidasas serínicas que aún no han sido empleadas industrialmente. El objetivo general del presente trabajo consiste en obtener preparaciones proteolíticas a partir del látex de M. pomifera y emplearlas en la producción de péptidos bioactivos a partir de proteínas de soja para ser evaluados como posibles ingredientes de alimentos funcionales. El desarrollo del plan comprende el empleo de la siguiente metodología experimental.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Obtención de extractos crudos a partir del látex de M. pomifera, purificación parcial por precipitación con solventes orgánicos y purificación cromatográfica de las proteasas de interés. Evaluación de la actividad enzimática sobre caseína, hemoglobina y GIp-Ala-AIa-Leu-NHC6H4NO, calculando en este último caso las constantes cinéticas. Caracterización del sistema proteolítico por SDS-PAGE, IEF-zimograma y espectrometría de masas. Obtención de hidrolizados de aislado proteico de soja y seguimiento de las digestiones por determinación del grado de hidrólisis y por tricina-SDS PAGE. Determinación de actividades biológicas en los hidrolizados: a-Antimicrobiana sobre diferentes bacterias gram-positivas, gram-negativas y levaduras mediante ensayos de difusión y en medio líquido para determinar la concentración inhibitoria y bactericida mínimas. b-Inhibitoria de la ECA empleando el sustrato fluorogénico Abz-PheArgLys(Dnp)Pro-OH. c-Quelante de metales por el método de la ferrosina. Purificación de péptidos bioactivos por cromatografía en fase reversa y de exclusión. Los picos que resulten de interés serán analizados por MALDI-TOF/TOF MS/MS para determinar su masa molecular y secuencia aminoacídica

Preparation of soy protein hydrolysates with antioxidant activity by using peptidases from latex of Maclura pomifera fruits

A partially purified proteolytic extract prepared from Maclura pomifera latex was employed in hydrolyzing a soybean-protein isolate (4.2 mg/mL). The hydrolysis-product formation, monitored by tricine–sodium-dodecyl-sulfate–polyacrylamyde-gel electrophoresis and reverse-phase high-performance liquid chromatography, indicated that after 10 min of reaction the main soybean proteins disappeared. The maximum degree of hydrolysis was 36.2% after a 180-min digestion. The 90-min hydrolysate presented an IC50 of 31.6 ± 0.2 µg/mL, and a trolox equivalent antioxidant capacity of 157.6 and 176.9 µmoles TE per g of peptide determined by two different methods. Analysis by matrix-assisted–laser-desorption-ionization–time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), followed by the application of bioinformatics tools, enabled the deduction of fourteen theoretical peptide sequences containing antioxidant amino acids at >60%, none of which sequences had been previously reported as antioxidants. Finally, we consider that this 90-min hydrolysate would constitute a promising ingredient in the manufacture of functional foods.Instituto de Fisiología VegetalCentro de Investigación de Proteínas Vegetale

Screening of plant peptidases for the synthesis of arginine-based surfactants

Partially purified preparations with proteolytic activity, obtained from South American native plants, were used as biocatalysts in condensation reactions of N-protected arginine alkyl ester derivatives with decylamine and dodecylamine in low-water content systems. The final products are cationic surfactants with potential application as emulsifiers and preservatives. Most of the proteolytic extractswere obtained from latex of species belonging to the Asclepiadaceae family (araujiain from Araujia hortorum, asclepain c from Asclepias curassavica and funastrain from Funastrum clausum). Hieronymain was obtained from unripe fruits of Bromelia hieronymi (Bromeliaceae). Plant proteases from commercial sources (papain and bromelain) were also tested as catalysts in the same reactions. Araujiain and funastrain furnished good reaction conversions (60–84%, with a ratio synthesis/hydrolysis of 2–5) similar to those obtained with commercial papain. Moreover, araujiain was the biocatalyst which rendered the best conversions (60%) for the synthesis of the two novel Bz-Arg-NH-dodecylamide (Bz-Arg-NHC₁₂) and Bz-Arg-NH-decylamide (Bz-Arg-NHC₁₀) derivatives. Moderate to poor conversions (10–50%, showing a ratio synthesis/hydrolysis of 0.5–1) were achieved with asclepain c, hieronymain and bromelain. The screening presented in this work revealed that, although these are structurally similar, their behavior for the synthesis of this kind of products differ among them.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Isolation and Characterization of Hieronymain II, Another Peptidase Isolated from Fruits of <i>Bromelia hieronymi</i> Mez (Bromeliaceae)

From unripe fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae), a partially purified protease preparation was obtained by acetone fractionation of the crude extract. Purification was achieved by anionic exchange chromatography (FPLC) on Q-Sepharose HP followed by cationic exchange chromatography (SP-Sepharose HP). Homogeneity of the new enzyme, named hieronymain II, was confirmed by SDS-PAGE and mass spectroscopy (MALDI-TOF-TOF). The molecular mass of was 23,411 Da, and maximum proteolytic activity (more than 90% of maximum activity) was achieved at pH 7.5-9.0 on casein and at pH 7.30-8.3 on Z-Phe-Arg-p-nitroanilide. The enzyme was completely inhibited by E-64 and iodoacetic acid and activated by the addition of cysteine. The N-terminal sequence of hieronymain II (AVPQSIDWRVYGAV) was compared with those of 12 plant cysteine proteases which showed more than 70% of identity. Kinetic enzymatic assays were made on Z-Phe-Arg-p-nitroanilide (Km = 0.72mM, kcat = 1.82 seg⁻¹, kcat/Km = 2.54seg⁻¹ mM⁻¹). No detectable activity could be found on PFLNA or Z-Arg-Arg-p-nitroanilide.Facultad de Ciencias ExactasCentro de Investigación de Proteínas Vegetale