Mise en place du diagnostic biochimique et moléculaire du déficit en dihydrolipoamide déshydrogénase (E3)

CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Investigations biochimiques et moléculaires des déficits en pyruvate déshydrogénase et étude d'une mutation intronique impliquant le facteur d'épissage SC35

Les déficits en pyruvate désydrogénase (PDH) constituent une des premières causes d'hyperlactatémie primaire chez les enfants atteints de maladies neurologiques mitochondriales. Un blocage de cette enzyme entraîne une élévation parallèle de la lactatémie et de la pyruvicémie (et du lactate et pyruvate dans le liquide céphalo-rachidien), avec un rapport lactate/pyruvate normal. Ces dosages simples sont le point de départ biologique de la recherche de déficit en PDH pour tous les patients et la majorité des patientes. Nous présentons dans la première partie de ce travail les résultats obtenus au laboratoire pour une cohorte de 30 patients. Dix-huit d'entre eux présentaient un anomalie au niveau du gène PDHA1(Xp22.1-Xp22.2), quatre au niveau du gène PDHX (11p13). Pour un patient, nous avons diagnostiqué un déficit en E3 (7p31.1-7q32), sous-unité commune à trois déshydrogénases mitochondriales dont la PDH. Pour sept patients, nous n'avons pas identifié d'anomalie moléculaire malgré des signes clinico-biologiques trés évocateurs. Ces données sont discutées et comparées à celles de la littérature. Une proposition de conduite à tenir pour le diagnostic, en fonction des nouveaux outils d'analyse enzymatique et moléculaire que nous avons développés. Sera développée à la fin du document. Dans la seconde partie, nous détaillons les investigations moléculaires plus approfondies des déficits en PDH. Nous présentons la mise en place d'outils préliminaires qui permettront l'étude de la fonctionnalité des nouvelles mutations faux-sens chez S. cerevisiae. Nous revenons en détail sur la détection de deux délétions intragéniques (sur les gènes PDHA1 et PDH X), sur l'étude d'un mosaïcisme somatique chez un garçon présentant une mutation au niveau du gène PDHA1 et sur deux mutations entraînant une dégradation de l'ARNm par le mécanisme de "Nonsense mRNA mediated Decay" (gènes PDHA1 et E3BP). Nous terminons par un récapitulatif des anomalies d'épissage. Dans la dernière partie, nous étudions le mécanisme moléculaire d'une mutation ponctuelle intronique sur la séquence du gène PGHA1, conduisant à une rétention partielle d'un intron au niveau de l'ARNm. Nous montrons par épissage in vitro que cette mutation intronique (IVS7+26G>A)entraîne l'utilisation d'un site cryptique d'épissage, "GT" en position 46 et 47 de l'intron 7. Ainsi que l'avait prédit le programme "ESE finder", nous montrons par UV-crosslinking que la protéine SC35, facteur d'épissage de la famille des protéines SR, se fixe avec une plus grande affinité sur la séquence intronique mutée G>A (ESE), entraînant ainsi une utilisation préférentielle du site donneur cryptique. Nous montrons enfin, qu'une déplétion en SC35 (obtenue par l'utilisation de SiRNA) sur les fibroblastes du patient entraîne une disparition de l'ARNm anormalement épissé . Ce travail démontre l'implication de l'interaction SC35/ESE et le rôle des séquences introniques en pathologie humaine. De plus, il ouvre de nombreuses voies de recherche au niveau de la thérapie des anomalies d'épissage.PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

A novel mutation of the ACADM gene (c.145C>G) associated with the common c.985A>G mutation on the other ACADM allele causes mild MCAD deficiency: a case report.

International audienceA female patient, with normal familial history, developed at the age of 30 months an episode of diarrhoea, vomiting and lethargy which resolved spontaneously. At the age of 3 years, the patient re-iterated vomiting, was sub-febrile and hypoglycemic, fell into coma, developed seizures and sequels involving right hemi-body. Urinary excretion of hexanoylglycine and suberylglycine was low during this metabolic decompensation. A study of pre- and post-prandial blood glucose and ketones over a period of 24 hours showed a normal glycaemic cycle but a failure to form ketones after 12 hours fasting, suggesting a mitochondrial β-oxidation defect. Total blood carnitine was lowered with unesterified carnitine being half of the lowest control value. A diagnosis of mild MCAD deficiency (MCADD) was based on rates of 1-14C-octanoate and 9, 10-3H-myristate oxidation and of octanoyl-CoA dehydrogenase being reduced to 25% of control values. Other mitochondrial fatty acid oxidation proteins were functionally normal. De novo acylcarnitine synthesis in whole blood samples incubated with deuterated palmitate was also typical of MCADD. Genetic studies showed that the patient was compound heterozygous with a sequence variation in both of the two ACADM alleles; one had the common c.985A>G mutation and the other had a novel c.145C>G mutation. This is the first report for the ACADM gene c.145C>G mutation: it is located in exon 3 and causes a replacement of glutamine to glutamate at position 24 of the mature protein (Q24E). Associated with heterozygosity for c.985A>G mutation, this mutation is responsible for a mild MCADD phenotype along with a clinical story corroborating the emerging literature view that patients with genotypes representing mild MCADD (high residual enzyme activity and low urinary levels of glycine conjugates), similar to some of the mild MCADDs detected by MS/MS newborn screening, may be at risk for disease presentation

E4F1 controls a transcriptional program essential for pyruvate dehydrogenase activity

The mitochondrial pyruvate dehydrogenase (PDH) complex (PDC) acts as a central metabolic node that mediates pyruvate oxidation and fuels the tricarboxylic acid cycle to meet energy demand. Here, we reveal another level of regulation of the pyruvate oxidation pathway in mammals implicating the E4 transcription factor 1 (E4F1). E4F1 controls a set of four genes [dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), dihydrolipoyl dehydrogenase (Dld), mitochondrial pyruvate carrier 1 (Mpc1), and solute carrier family 25 member 19 (Slc25a19)] involved in pyruvate oxidation and reported to be individually mutated in human metabolic syndromes. E4F1 dysfunction results in 80% decrease of PDH activity and alterations of pyruvate metabolism. Genetic inactivation of murine E4f1 in striated muscles results in viable animals that show low muscle PDH activity, severe endurance defects, and chronic lactic acidemia, recapitulating some clinical symptoms described in PDC-deficient patients. These phenotypes were attenuated by pharmacological stimulation of PDH or by a ketogenic diet, two treatments used for PDH deficiencies. Taken together, these data identify E4F1 as a master regulator of the PDC