Cloning and complete amino acid sequences of human and murine basement membrane protein BM-40 (SPARC, osteonectin)

AbstractAmino acid sequences of 285 and 286 residues, respectively, were deduced for mouse and human BM-40 from cDNA clones isolated from expression libraries. The sequences showed 92% identity and were also essentially identical to those of bone osteonectin and of the parietal endoderm protein SPARC. About 60% of the mouse BM-40 sequence was confirmed by Edman degradation. Two of the seven disulfide bonds were localized which apparently separate two distinct domains of mouse BM-40

The transporter associated with antigen processing: function and implications in human diseases

Abstract The transport of antigenic peptides from the cytosol to the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) is an essential process for presentation to cytotoxic T-lymphocytes. The transporter associated with antigen processing (TAP) is responsible for the intracellular translocation of peptides across the membrane of the ER. Efficient assembly of MHC-peptide complex requires the formation of a macromolecular transport and chaperone complex composed of TAP, tapasin and MHC class I molecules. Therefore, structure and function of TAP is important for the understanding of the immune surveillance. z 1999 Federation of European Biochemical Societies

Der Einfluss von Pdcd4 auf die Expression des Proteins Angiopoietin2

Pdcd4 (programmed cell death 4) ist ein neuer Tumorsuppressor. In vielen Tumoren oder während maligner Transformation ließen sich supprimierte Pdcd4 Mengen nachweisen. Hohe Pdcd4 Spiegel wiederum verhinderten eine neoplastische Umwandlung. Bislang schienen aber die Wirkungen von Pdcd4 abhängig vom Zelltyp zu sein. Ang2 (Angiopoietin2), ein Wachstumsfaktor, der an der Neubildung von Gefäßen beteiligt ist, könnte ein zelltypübergreifendes Zielgen von Pdcd4 darstellen. Eine gezielte Suppression von Pdcd4 mittels siRNA (siPdcd4) in verschiedenen Tumorzelllinien der Mamma, der Leber, des pankreatiko-gastro-intestinalen Traktes sowie in Endothelzellen bestätigte in Western Blots eine Steigerung von Ang2 Protein. Zusätzlich zeigte sich in semiquantitativen RT- und RTD-PCRs eine Regulierung auf transkriptionaler Ebene. Damit ist Ang2 tatsächlich ein in mehreren Tumorzelltypen reguliertes Zielgen von Pdcd4. Nachdem eine erhöhte Ang2 Proteinexpression unter Pdcd4 Suppression in Western Blot Untersuchungen belegt werden konnte, ließen sich auch in Mediumüberständen von stabil (shPdcd4) oder transient (siPdcd4) transfizierten Zelllinien erhöhte Ang2 Mengen im Vergleich zur Kontrolle nachweisen. Dies sprach für eine gesteigerte Sekretion von Ang2 Protein. Die funktionelle Bedeutung der erhöhten Ang2 Spiegel wurde in Tube Formation- und Boyden Chamber Assays untersucht und dabei die immortalisierte humane mikrovaskuläre endotheliale Zelllinie HMEC-1 verwendet. Die im konditionierten Medium von stabil shPdcd4 transfizierten BON-1- und HCT116-Zellen erhöhten Ang2 Spiegel führten in Tube Formation Assays, im Vergleich zum Kontrollmedium, zu einer gesteigerten Gefäßneubildung. Anhand von Verzweigungen und Länge der Tubes erfolgte eine Software-basierte Auswertung. Bestätigt wurden diese Ergebnisse in Tube Formation Assays mit rekombinanten Ang2. Dabei ließen sich im Einklang mit der bestehenden Literatur zwei Auswirkungen nachweisen. Zum einen zeigten sich proangiogenetische Effekte von Ang2 in Verbindung mit Medium mit 10% FBS, zum anderen gefäßregressive Wirkungen von Ang2 in Medium mit 1% FBS. Vermutlich liegt das an den unterschiedlichen VEGF Konzentrationen, die mit steigendem FBS Gehalt des Mediums auch zunehmen. Zusätzlich ließ sich die Fähigkeit von Ang2, Migration von endothelialen Zellen zu fördern, in Boyden Chamber Assays nachweisen. Hierbei zeigten die gesteigerten Ang2 Konzentrationen im konditionierten Medium der stabil transfizierten BON-1- und HCT116 Zellen mit 1% und 10% FBS promigratorische Effekte auf die HMEC-1 Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Ang2 in diversen Tumorzelllinien ein Zielgen des Tumorsuppressors Pdcd4 ist. Durch Verringerung von Pdcd4 mittels siRNA wurde Ang2 vermehrt transkribiert, translatiert und sezerniert. Die funktionelle Bedeutung der gesteigerten Ang2 Sekretion ließ sich in Tube Formation Assays (angiogenetische Wirkung) und Boyden Chamber Assays (promigratorische Wirkung) nachweisen. Mit der Steuerung von Ang2 durch Pdcd4 bindet sich der Tumorsuppressor direkt in die Neoangiogenese von Tumoren ein und unterstreicht damit seine Bedeutung in der Entwicklung maligner Neoplasien. Insgesamt gesehen ist eine Wiederherstellung der Pdcd4 Expression in Tumoren und die damit verbundene Überführung in die aktive Rolle als Tumorsuppressor ein Hauptanliegen möglicher therapeutischer Ansätze

Die Wirkung von Pioglitazon auf das Proteom einer humanen neuroendokrinen Pankreaskarzinom-Zelllinie

Neuroendokrine Tumore stellen auch heute noch sowohl ein diagnostisches als auch therapeutisches Problem dar, weswegen weiterhin intensive Forschung notwendig ist, um Patienten mit dieser Erkrankung eine höhere Chance auf Heilung zu bieten. PPARγ-Agonisten wie Pioglitazon werden klinisch bereits in der Diabetes-Therapie eingesetzt. Es gibt allerdings Daten, die sowohl auf antikanzerogene als auch auf kanzerogene Effekte dieser Wirkstoffgruppe hinweisen. Daher wurde in dieser Arbeit die Wirkung von Pioglitazon auf das Proteom von Bon-1-Zellen untersucht, einer humanen neuroendokrinen Pankreaskarzinom-Zelllinie. Es zeigte sich, dass Pioglitazon-Behandlung in Bon-1-Zellen zu einer vermehrten Spaltung von HSP 90 führt. HSP 90 ist ein molekulares Chaperon, das eine Schlüsselrolle in vielen Zell-Signalwegen spielt und so den Eintritt der Zelle in die Apoptose verhindern kann. Ebenso ist es maßgeblich an der Entwicklung und Aufrechterhaltung derjenigen Eigenschaften von Tumorzellen beteiligt, die zu malignem Wachstum führen. Es musste jedoch festgestellt werden, dass die vermehrte Spaltung von HSP 90 anscheinend nicht zu einer signifikanten Abnahme der Gesamtmenge an HSP 90 führt, und deswegen keine Regulation von Proteinen in HSP-90-beeinflussten Signalwegen nachgewiesen werden konnte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation von Bon-1-Zellen mit Pioglitazon zu einer Verminderung der intrazellulären Menge an CgA und SgII führt. Dieser Effekt wird nicht durch eine verminderte Expression, sondern durch eine verstärkte Sekretion erzielt. Der gleiche Effekt wurde durch Lankat-Buttgereit et al. in einer mit Pdcd4-si-RNA-transfizierten Bon-1-Zelllinie nachgewiesen. In beiden Fällem schien die gesteigerte Sekretion sowohl durch eine vermehrte Expression der Proprotein-Convertase 1 (PC1) als auch durch eine vermehrte Aktivierung der Kinase Akt, reguliert über den PI3-Kinase-Weg, bedingt zu sein. Übereinstimmend hiermit wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass Pioglitazon in Bon-1-Zellen zu erniedrigten Pdcd4-Spiegeln und infolgedessen zur Aktivierung von Akt, zu gesteigerter PC1-Expression und hierdurch zu vermehrter CgA- und SgII-Sekretion führt. CgA dient als Serummarker für neuroendokrine Tumore und PC1 ist in erhöhten Mengen in verschiedenen Tumorarten zu finden. SgII ist das Vorläuferprotein von Secretoneurin (SN) und wird durch PC1 zu diesem prozessiert. SN spielt eine Rolle bei der Hypoxie-induzierten Neovaskularisation in ischämischen Erkrankungen und soliden Tumoren. Erhöhte PC1-Spiegel unter Pioglitazon-Behandlung mögen jedoch auch zur antidiabetischen Wirkung von Pioglitazon beitragen, indem es zu einer vermehrten Prozessierung von Proinsulin und Proglucagon zu Insulin und dem insulinotrop wirkenden Glucagon-like-Peptide-1 (GLP-1) kommt. Die erzielten Ergebnisse geben weiteren Anlass zu der Auffassung, dass der klinische Einsatz von Pioglitazon erneut reevaluiert werden sollte

Molekularbiologische Untersuchungen zum Wirkmechanismus des ppar-gamma Agonisten Piotglitazon auf die humanen Kolonkarzinom-Zelllinien HCT-116 und HT-29

Die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms (KRK) hat seit 1975 ständig zugenommen und ist heute mit über einer Million Neuerkrankungen pro Jahr der dritthäufigste Tumor weltweit. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung des KRK von entscheidender Bedeutung. Eine dieser neuen Therapiemöglichkeiten könnte die Aktivierung des „peroxisome proliferator activated rezeptor“ (PPAR) durch Thiazolidindionen (TZDs) darstellen. TZDs, zu denen auch Pioglitazon gehört, umfassen eine Gruppe von Medikamenten, die ursprünglich zur Therapie des Diabetes Typ-II entwickelt wurden. In den letzten Jahren hat sich jedoch gezeigt, dass TZDs über die Aktivierung von PPAR-γ nicht nur einen antidiabetischen, sondern ebenfalls einen antiproliferativen Effekt auf diverse Tumorzellen besitzen. Um zu untersuchen, ob dies auch auf HCT-116 und HT-29 Zellen zutrifft, wurde zunächst die Expression von PPAR-γ in HCT-116 und HT-29 Zellen nachgewiesen. Die Inkubation der Zellen mit 40μM Pioglitazon führte in beiden Zelllinien zu einer deutlichen Reduktion des Zellwachstums unter Pioglitazon-Behandlung. Dieser antiproliferative Effekt war verbunden mit einer Erniedrigung der LDH-Aktivität, einem Marker für stattgefundenen Zelltod. Sowohl Wachstumshemmung als auch die Erniedrigung der LDH-Aktivität waren durch Blockade von PPAR-γ mittels des selektiven Inhibitor GW9662 reversibel, wodurch die PPAR-γ-Abhängigkeit der Pioglitazon-Wirkung auf das Wachstum von HCT-116 und HT-29 Zellen bewiesen werden konnte. Passend zu diesen Ergebnissen ergaben durchflusszytometrische Untersuchungen von HCT-116 Zellen eine nur mäßig gesteigerte Apoptoserate, wohingegen der Zellzyklus eine Arretierung der Zellen in der G0/G1-Phase aufwies. Dieser G0/G1-Arrest hatte eine verminderte Proteinexpression der am Zellzyklus beteiligten Enzyme cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 zur Folge, wohingegen keine Regulation von pro-apoptotischen Enzymen wie Caspase 3, 9, 10 und p53 zu beobachten war. Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen der Pioglitazon-Wirkung und der TRAIL-vermittelten Apoptose zeigten in HT-29 Zellen einen synergistischen Effekt bei gleichzeitiger Inkubation der Zellen mit Pioglitazon und TRAIL, welcher sich bei den HCT-116 Zellen jedoch nicht nachweisen ließ. Interessanterweise fand sich unter Pioglitazon-Behandlung auch eine Erniedrigung der Proteinexpression von pdcd4, einem Tumorsupressor-Protein, welches über die Inhibition von eIF4A auf die Translation wirkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Aktivierung von PPAR-γ einen Einfluss auf die Proteinexpression von pdcd4 besitzt. Der gleiche Effekt konnte bei der Inkubation von Jurkat-Leukämiezellen mit 40μM Pioglitazon nachgewiesen werden. Die stabile Transfektion von HCT-116 Zellen mit siRNA gegen pdcd4 resultierte ebenfalls in einer Wachstumshemmung, was die Vermutung nahe legt, dass ein basaler Proteinspiegel an pdcd4 für den normalen Ablauf des Zellwachstums unerlässlich ist. Zweidimensionale Gelelektrophoresen von HCT-116-Gesamtproteinextrakten zeigten eine Hyperphosphorylierung von Zytokeratin 19. Zytokeratine (CKs) gehören zu den Intermediärfilamenten und sind wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts. Die Phosphorylierung ist eine wichtige regulatorische Modifikation für die Funktion von Zytokeratinen und erhöht deren Löslichkeit. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Behandlung mit TZDs zu einer vermehrten Phosphorylierung von CK 19 führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pioglitazon seinen wachstumshemmenden Effekt auf HCT-116 Zellen über die Erniedrigung der Proteinexpression von cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 vermittelt, was einen G0/G1-Arrest zur Folge hat. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung von Karzinomen stellt somit die Aktivierung von PPAR-γ über TZDs oder andere, noch effektivere Agonisten eine Erfolg versprechende Therapieoption dar

Expression of the ras-related rab3a gene in insulinoma-derived cell lines

AbstractThis study was designed to search for the expression of the small-molecular-weight GTP-binding protein rab3a in endocrine pancreatic cell lines. Total RNA was isolated from five different cell lines (RINm5F, RIN 104836, β-TC1, HIT-15, and INRI-G9) and from whole rat brain. The expression of rab3a was analyzed by Northern blots. Similar as in brain two transcripts of 1300 and 1800 bp were detected in RIN-cells at low stringency conditions with the predominant signal at 1300 bp. At high stringency the stronger signal was at 1800 bp. When a 300 bp PstI fragment derived from the coding region of rab3a was utilized as probe the 1800 bp signal was predominant under each condition. Only a faint band at 1800 bp occurred in preparations from βTCI-cells and no signal at all was found in HIT-15 and INRI-G9-cells. In conclusion, rab3a is expressed in rat insulin-releasing insulinoma-derived RIN-cells with a specific 1800 bp transcription product

Inactivation of PRIM1 Function Sensitizes Cancer Cells to ATR and CHK1 Inhibitors

The phosphoinositide 3-kinase–related kinase ATR is a central regulator of the DNA damage response. Its chemical inhibition eliminates subsets of cancer cells in various tumor types. This effect is caused at least partly by the synthetically lethal relationship between ATR and certain DNA repair genes. In a previous screen using an siRNA library against DNA repair genes, we identified PRIM1, a part of the polymerase α-primase complex, as acting synthetically lethal with ATR. Applying a genetic ATR knock-in model of colorectal cancer cells, we confirmed that PRIM1 depletion inhibited proliferation of ATR-deficient cells and excluded artifacts due to clonal variation using an ATR reexpressing cell clone. We expanded these data by demonstrating in different cell lines that also chemical inhibition of ATR or its main effector kinase CHK1 reduces proliferation upon depletion of PRIM1. Mechanistically, PRIM1 depletion in ATR-deficient cells caused S-phase stasis in the absence of increased DNA damage followed by Wee1-mediated activation of caspase 8 and apoptosis. As PRIM1 inactivation sensitizes cancer cells to ATR and CHK1 inhibitors, mutations in PRIM1 or other components of the polymerase α-primase complex could represent novel targets for individualized tumor therapeutic approaches using ATR/CHK1 inhibitors, as has been previously demonstrated for POLD1, the catalytic subunit of polymerase δ