Estudio de la regulación fisiológica y de la participación de vinculina en el mantenimiento de las estructuras de adhesión celular en los túbulos colectores de la papila renal

Fil: Brandán, Yamila Romina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLos túbulos colectores (TC) renales están formados por un epitelio simple, y su organización tisular y función requieren de la presencia de estructuras de adhesión celular, como son los contactos focales (CF) y las uniones adherentes (UA), que conectan el citoesqueleto de actina con la matriz extracelular, o con los complejos de unión célula-célula, respectivamente. Esta conexión se establece básicamente debido a la presencia de vinculina, molécula que posee sitios de unión a lípidos de membrana, a actina y a proteínas que forman parte de ambas estructuras de adhesión celular. En trabajos previos realizados con células de TC de papila renal, se demostró que la hormona bradiquinina (BK) provoca una reestructuración reversible de los CF, induciendo la movilización de vinculina, con la aparición simultánea en el citosol de vesículas conteniendo esta proteína. Estos trabajos pioneros sirvieron de base para la realización del presente trabajo de tesis.\nSe eligió como modelo de estudio cultivos primarios de células de TC de papila renal de ratas adultas. Se observó que estas células conservan in vitro las características típicas de las células de TC en el tejido intacto. Este comportamiento se vio reflejado por el crecimiento en monocapas, la expresión de los glicoconjugados (DBA+) característicos de este tipo celular, filamentos intermedios constituidos por citoqueratina-7, la formación de UA y el desarrollo de un cilio primario.\nEn la primera parte de la tesis se realizaron estudios bioquímicos y morfológicos de las vesículas que contienen vinculina. Para ello, se utilizaron muestras enriquecidas en vesículas obtenidas de cortes delgados de papila renal, estimulados con BK. Para el aislamiento de las vesículas se puso en práctica un método inmunomagnético, utilizando un anticuerpo dirigido contra vinculina. Se demostró que la vinculina se asocia de forma periférica a la membrana de las vesículas, orientada hacia el citosol, a través de interacciones electrostáticas. El análisis por Western Blot y espectrometría de masa demostró que contienen, además de vinculina, PI(4,5)P2, componentes del retículo endoplasmático (RE) y del citoesqueleto, y marcadores del compartimiento endosomal de reciclaje (Rab 5, Rab 11 y el receptor de transferrina), poniendo en evidencia la heterogeneidad de las mismas. Sobre la base de los resultados obtenidos, se propuso un modelo dinámico de distribución intracelular de vinculina. Es sabido que cuando no forma parte de las estructuras de adhesión, la vinculina conforma un pool citosólico. Los resultados obtenidos demostraron que, además de una forma libre, la vinculina también presenta una forma asociada a vesículas. Se planteó la existencia de dos poblaciones de vesículas: una localizada muy cerca del núcleo cuya función sería de reservorio, denominada circuito de tránsito restringido de vesículas entre el RE y el aparato de Golgi; y otra localizada en la zona marginal de la célula, que representa un circuito corto de reciclaje de endosomas\ntempranos, los que participarían del recambio basal de la vinculina asociada a los CF. Cuando se estimulan las células con BK, ocurren dos fenómenos. Por un lado, vinculina se disipa de los CF, la que es captada por las vesículas Rab 5+ preexistentes, que forman parte del circuito corto de reciclaje localizado en la región marginal, y a tiempos prolongados de estimulación, estas vesículas adquieren Rab 11. Esto indica que la estimulación con BK promueve una movilización de vesículas del reservorio, desde el aparato de Golgi hacia la membrana plasmática, para lograr reestablecer las condiciones basales. Además, se demostró que los microtúbulos participan en el transporte de las vesículas que contienen vinculina. Por lo tanto, BK induce una reestructuración reversible de los CF y no su desarmado.\nTrabajos previos demostraron que las proteínas que forman parte de los CF y UA, entre ellas vinculina, se localizan en microdominios rafts enriquecidos en colesterol y esfingomielina (SM). En la segunda parte de la tesis se estudió la participación de vinculina en el mantenimiento de las estructuras de adhesión celular. Para ello, las células de TC fueron incubadas en presencia de un inhibidor farmacológico, o transfectadas con un ARN de interferencia específico para las enzimas SM sintasa 1 y 2, presentes en el aparato de Golgi y membrana plasmática respectivamente, con el objetivo de disminuir su expresión. Solo la inhibición de la SM sintasa 1 produjo un deterioro de las UA, provocando la pérdida de unión entre las células. Paralelamente, se observó un incremento de la cantidad de CF que contenía vinculina, pero no talina. Puesto que la SM sintasa 1 se localiza en el aparato de Golgi, y su actividad es esencial para la formación de vesículas, el deterioro observado sobre las UA podría deberse a modificaciones en la formación de vesículas que participan en el proceso de transporte y reciclado de los complejos adherentes. Mientras que el aumento de los CF cumpliría un mecanismo compensatorio de las células ante la disolución de las uniones intercelulares, con el fin de mantenerse adheridas a la matriz extracelular, y de esta forma asegurar su supervivencia.\nEn conclusión, los resultados presentados en este trabajo de tesis doctoral aportan nuevas evidencias experimentales que resaltan la participación de la molécula de vinculina en los mecanismos que regulan la plasticidad celular, como lo es la pérdida o mantenimiento de estructuras de adhesión, para responder a cambios que se producen en su entorno sin perder la viabilida

Bradykinin mediates the association of collecting duct cells to form migratory colonies, through B2 receptor activation

It is known that bradykinin (BK) B2 receptor (B2R) is expressed in the collecting duct (CD) cells of the newborn rat kidney, but little is known about its role during early postnatal life. Therefore, we hypothesize that BK could participate in the mechanisms that mediate CD formation during the postnatal renal development. Performing primary cultures, combined with biochemical, immunocytochemical, and time‐lapse analysis, we studied the role of BK in CD cell behavior isolated from renal papilla of neonatal rats. A reverse relationship was observed between B2R expression and the degree of CD epithelial cell sheet maturation. BK stimulation induced CD cell association upon B2R activation. The lack of B2R expression in cells showing mature adherens junctions suggested that BK is mostly involved in early adhesive events, thus favoring the initial formation of CD during development. Time‐lapse analysis revealed that BK induced a high protrusive activity of CD cells, denoted by ruffle formation and lamellipodia extension. PI3K was involved in the BK‐induced CD cell‐cell association and the acquisition of the migratory phenotype since, when inhibited, membrane ruffles, and filopodia between cells diminished. Results indicate that the actions of BK mediated by PI3K activation were due to the downstream Akt and Rac pathways. This study, performed with CD cells that were not genetically manipulated, provides new experimental evidence supporting a novel role of BK in rat renal CD organization. As B2R blockade results in abnormal tubular differentiation, our results contribute to better understanding the etiology of human congenital renal malformation and diseases.Fil: Guaytima, Edith del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Brandán, Yamila Romina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Favale, Nicolas Octavio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Santacreu, Bruno Jaime. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas; ArgentinaFil: Sterin, Norma Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Marquez, Maria Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; Argentin

Physiologically induced restructuring of focal adhesions causes mobilization of vinculin by a vesicular endocytic recycling pathway

AbstractIn epithelial cells, vinculin is enriched in cell adhesion structures but is in equilibrium with a large cytosolic pool. It is accepted that when cells adhere to the extracellular matrix, a part of the soluble cytosolic pool of vinculin is recruited to specialized sites on the plasma membrane called focal adhesions (FAs) by binding to plasma membrane phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). We have previously shown that bradykinin (BK) induces both a reversible dissipation of vinculin from FAs, by the phospholipase C (PLC)-mediated hydrolysis of PtdIns(4,5)P2, and the concomitant internalization of vinculin. Here, by using an immunomagnetic method, we isolated vinculin-containing vesicles induced by BK stimulation. By analyzing the presence of proteins involved in vesicle traffic, we suggest that vinculin can be delivered in the site of FA reassembly by a vesicular endocytic recycling pathway. We also observed the formation of vesicle-like structures containing vinculin in the cytosol of cells treated with lipid membrane-affecting agents, which caused dissipation of FAs due to their deleterious effect on membrane microdomains where FAs are inserted. However, these vesicles did not contain markers of the recycling endosomal compartment. Vinculin localization in vesicles has not been reported before, and this finding challenges the prevailing model of vinculin distribution in the cytosol. We conclude that the endocytic recycling pathway of vinculin could represent a physiological mechanism to reuse the internalized vinculin to reassembly new FAs, which occurs after long time of BK stimulation, but not after treatment with membrane-affecting agents

Novel cellular mechanism that mediates the collecting duct formation during postnatal renal development

We have previously demonstrated that kidney embryonic structures are present in rats, and are still developing until postnatal Day 20. Consequently, at postnatal Day 10, the rat renal papilla contains newly formed collecting duct (CD) cells and others in a more mature stage. Performing primary cultures, combined with immunocytochemical and time-lapse analysis, we investigate the cellular mechanisms that mediate the postnatal CD formation. CD cells acquired a greater degree of differentiation, as we observed that they gradually lose the ability to bind BSL-I lectin, and acquire the capacity to bind Dolichos biflorus. Because CD cells retain the same behavior in culture than in vivo, and by using DBA and BSL-I as markers of cellular lineage besides specific markers of epithelial/mesenchymal phenotype, the experimental results strongly suggest the existence of mesenchymal cell insertion into the epithelial CD sheet. We propose such a mechanism as an alternative strategy for CD growing and development.Fil: Guaytima, Edith del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Brandán, Yamila Romina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Favale, Nicolas Octavio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Sterin Speziale, Norma B.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Márquez, María Gabriela. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; Argentin

The inhibition of sphingomyelin synthase 1 activity induces collecting duct cells to lose their epithelial phenotype

Epithelial tissue requires that cells attach to each other and to the extracellular matrix by the assembly of adherens junctions (AJ) and focal adhesions (FA) respectively. We have previously shown that, in renal papillary collecting duct (CD) cells, both AJ and FA are located in sphingomyelin (SM)-enriched plasma membrane microdomains. In the present work, we investigated the involvement of SM metabolism in the preservation of the epithelial cell phenotype and tissue organization. To this end, primary cultures of renal papillary CD cells were performed. Cultured cells preserved the fully differentiated epithelial phenotype as reflected by the presence of primary cilia. Cells were then incubated for 24 h with increasing concentrations of D609, a SM synthase (SMS) inhibitor. Knock-down experiments silencing SMS 1 and 2 were also performed. By combining biochemical and immunofluorescence studies, we found experimental evidences suggesting that, in CD cells, SMS 1 activity is essential for the preservation of cell-cell adhesion structures and therefore for the maintenance of CD tissue/tubular organization. The inhibition of SMS 1 activity induced CD cells to lose their epithelial phenotype and to undergo an epithelial-mesenchymal transition (EMT) process.Fil: Brandán, Yamila Romina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Guaytima, Edith del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; ArgentinaFil: Favale, Nicolas Octavio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Biología Celular y Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Pescio, Lucila Gisele. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Ciencias Biológicas. Cátedra de Biología Celular y Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Sterin, Norma Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Marquez, Maria Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Rioja. Departamento de Ciencias de la Salud y Educación. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud Humana; Argentin