Dysplasies osseuses héréditaires et voies de signalisation associées aux récepteurs FGFR3 et PTHR1

La croissance des os longs se fait selon un processus complexe impliquant la migration et la condensation de cellules mésenchymateuses en cellules chondrogéniques qui se différencient en chondrocytes produisant la matrice cartilagineuse pour former la plaque de croissance. De nombreux facteurs protéiques sont impliqués dans la régulation de ces phénomènes parmi lesquels des facteurs transcriptionnels, des facteurs de signalisation et des protéines de la matrice extracellulaire dont le rôle a été révélé grâce aux études de génétique moléculaire sur des dysplasies osseuses humaines et à la création de modèles animaux reproduisant certaines de ces maladies. Cet article se focalise sur deux récepteurs, FGFR3 et PTHR1, dont l’importance dans la croissance des os longs est illustrée par le groupe de dysplasies osseuses qui leurs sont associées. Des résultats récents indiquent que prolifération et différenciation chondrocytaires sont étroitement liées et que la croissance harmonieuse des os longs repose sur un équilibre strict entre différentes voies de signalisation dont celles contrôlées par ces facteurs.Skeletal development is a highly sophisticated process involving, as a first step, migration and condensation of mesenchymal cells into osteoprogenitor cells. These cells further differentiate into chondrocytes and osteoblasts through multiple differentiation stages requiring a set of specific transcriptional factors. Defective endochondral ossification in human is associated with a large number of inherited skeletal dysplasias caused by mutations in genes encoding extracellular matrix components, growth factors and their receptors, signaling molecules and transcription factors. This review summarizes some of the recent findings on a series of chondrodysplasias caused by mutations in FGFR3 and PTHR1, two receptors expressed in the cartilage growth plate and mediating two main signaling pathways. Data from human diseases and relevant animal models provide new clues for understanding how signaling molecules and their interaction with key transcription factors control and regulate the development and growth of long bones

Undersulfation of proteoglycans synthesized by chondrocytes from a patient with achondrogenesis type 1B homozygous for an L483P substitution in the diastrophic dysplasia sulfate transporter.

Achondrogenesis type 1B is an autosomal recessive, lethal chondrodysplasia caused by mutations in the gene encoding a sulfate/chloride antiporter of the cell membrane (Superti-Furga, A., Hastbacka, J., Wilcox, W. R., Cohn, D. H., van der Harten, J. J., Rossi, A., Blau, N., Rimoin, D. L., Steinmann, B., Lander, E. S., and Gitzelmann, R. (1996) Nat. Genet. 12, 100-102). To ascertain the consequences of the sulfate transport defect on proteoglycan synthesis, we studied the structure and sulfation of proteoglycans in cartilage tissue and in fibroblast and chondrocyte cultures from a fetus with achondrogenesis 1B. Proteoglycans extracted from epiphyseal cartilage and separated on agarose gels migrated more slowly than controls and stained poorly with alcian blue. The patient's cultured cells showed reduced incorporation of [35S]sulfate relative to [3H]glucosamine, impaired uptake of sulfate, and higher resistance to chromate toxicity compared to control cells. Epiphyseal chondrocytes cultured in alginate beads synthesized proteoglycans of normal molecular size as judged by gel filtration chromatography, but undersulfated as judged by ion exchange chromatography and by the amount of nonsulfated disaccharide. High performance liquid chromatography analysis of chondroitinase-digested proteoglycans showed that sulfated disaccharides were present, although in reduced amounts, indicating that at least in vitro, other sources of sulfate can partially compensate for sulfate deficiency. A t1475c transition causing a L483P substitution in the eleventh transmembrane domain of the sulfate/chloride antiporter was present on both alleles in the patient who was the product of a consanguineous marriage. The results indicate that the defect of sulfate transport is expressed in both chondrocytes and fibroblasts and results in the synthesis of proteoglycans bearing glycosaminoglycan chains which are poorly sulfated but of normal length

Étude du mécanisme d'action antitumorale et immunoadjuvante d'un glycolipide synthétique, le tétrapalmitate de maltose et de ses analogues

Plusieurs glycolipides synthétiques ont été préparés en estérifiant les fonctions hydroxyles d'un disaccharide (le maltose) par des chlorures d'acides gras de nature saturée ou insaturée et dont la longueur de la chaîne carbonée variait de C16 à C18. Le produit brut obtenu était constitué d'un mélange de dérivés correspondant à un nombre variable de résidus hydroxyles estérifiés et qui pouvaient être séparés par chromatographie sur couche mince. Certaines bandes ont été sélectionnées sur la base de leur pouvoir mitogène et de leur capacité d'accroître la réponse humorale dirigée contre un xénoantigène (globule rouge de mouton). L'effet antitumoral des dérivés choisis a été évalué chez le rat Fischer porteur de l'adénocarcinome mammaire 13762 sous forme solide ainsi que chez la souris Suisse porteuse du carcinome ascitique d'Ehrlich. La principale observation réside dans le fait que les glycolipides composés d'acides gras saturés présentent une meilleure activité antitumorale que les dérivés à base d'acides gras insaturés, résultat qui est partiellement en accord avec ceux obtenus lors des expériences impliquant la réponse immune. L'effet sur le système immunitaire de deux des glycolipides (MTP et MHS) qui produisaient la meilleure réponse antitumorale, a été évalué par des mesures de la réponse proliférative "in vitro" suite à une injection "in vivo" de l'un ou l'autre des dérivés à des temps variables précédant la récupération des cellules spléniques. Il ressort de cette étude qu'une injection de 10 µg de MHS (ou de MTP) 3 heures avant le sacrifice de l'animal, provoque une prolifération accrue des lymphocytes T cultivés en présence des mitogènes usuels (Con A et PHA) alors que la réponse des lymphocytes B est inchangée. Ce résultat qui diffère de ceux obtenus lorsque les glycolipides sont ajoutés "in vitro" à des lymphocytes spléniques où l'on observe alors une stimulation des cellules B, s'explique si l'on admet que la cellule cible du MHS ou du MTP injecté chez l'animal est le macrophage. Ces monocytes sont capables après stimulation par le MHS de relâcher l'interleukine 1, une monokine qui provoque la prolifération des cellules T. L'utilisation de MTP marqué au tritium a permis de vérifier que la radioactivité se retrouve en quantité détectable au niveau de la rate 3 heures après son injection ainsi que dans les ganglions lymphatiques. L'addition de ce même MTP marqué à des macrophages péritonéaux incubés "in vitro" se traduit par une intéraction stable avec la membrane du macrophage qui ne fait pas intervenir un récepteur spécifique mais rend possible le déclenchement du relâchement d'interleukine 1. L'injection du MTP à des rats porteurs de tumeurs (adénocarcinome mammaire) permet, lorsque ceux-ci ont été sensibilisés avec une dose sous optimale de cellules tumorales viables, de provoquer un rejet complet de la tumeur primaire alors que les animaux sensibilisés mais non traités ne montrent qu'un ralentissement de la croissance tumorale. À l'inverse, l'utilisation de cellules tuées ou une fraction antigénique soluble extraite au KCl 3M pour immuniser l'animal n'apporte aucune protection contre une dose optimale subséquente en présence ou en l'absence de glycolipide. Ces résultats indiquent que la tumeur utilisée est faiblement antigénique et que la viabilité des cellules est un prérequis nécessaire au développement d'une réaction immunitaire antitumorale. Dans ce cas, le MTP en provoquant un relâchement accru d'interleukine 1 par les macrophages responsables de la présentation de l'antigène aux précurseurs des cellules T inductrices, permet une meilleure différentiation de ces lymphocytes qui peuvent proliférer. Ils produisent dans un deuxième temps la différentiation des cellules T cytotoxiques qui deviennent alors capables de tuer spécifiquement les cellules tumorales. Ce phénomène peut cependant être rendu inopérant par la présence de macrophages suppresseurs dont l'existence a été démontrée dans la rate des animaux porteurs de la tumeur mammaire et sur lesquels le MTP ne semble avoir aucun effet. Nous en concluons que les glycolipides synthétiques stimulent de façon non spécifique le système immunitaire et qu'une certaine immunogénicité de la tumeur est nécessaire pour obtenir une activité antitumorale significative

Étude du mécanisme d'action antitumorale et immunoadjuvante d'un glycolipide synthétique, le tétrapalmitate de maltose et de ses analogues

Plusieurs glycolipides synthétiques ont été préparés en estérifiant les fonctions hydroxyles d'un disaccharide (le maltose) par des chlorures d'acides gras de nature saturée ou insaturée et dont la longueur de la chaîne carbonée variait de C16 à C18. Le produit brut obtenu était constitué d'un mélange de dérivés correspondant à un nombre variable de résidus hydroxyles estérifiés et qui pouvaient être séparés par chromatographie sur couche mince. Certaines bandes ont été sélectionnées sur la base de leur pouvoir mitogène et de leur capacité d'accroître la réponse humorale dirigée contre un xénoantigène (globule rouge de mouton). L'effet antitumoral des dérivés choisis a été évalué chez le rat Fischer porteur de l'adénocarcinome mammaire 13762 sous forme solide ainsi que chez la souris Suisse porteuse du carcinome ascitique d'Ehrlich. La principale observation réside dans le fait que les glycolipides composés d'acides gras saturés présentent une meilleure activité antitumorale que les dérivés à base d'acides gras insaturés, résultat qui est partiellement en accord avec ceux obtenus lors des expériences impliquant la réponse immune. L'effet sur le système immunitaire de deux des glycolipides (MTP et MHS) qui produisaient la meilleure réponse antitumorale, a été évalué par des mesures de la réponse proliférative "in vitro" suite à une injection "in vivo" de l'un ou l'autre des dérivés à des temps variables précédant la récupération des cellules spléniques. Il ressort de cette étude qu'une injection de 10 µg de MHS (ou de MTP) 3 heures avant le sacrifice de l'animal, provoque une prolifération accrue des lymphocytes T cultivés en présence des mitogènes usuels (Con A et PHA) alors que la réponse des lymphocytes B est inchangée. Ce résultat qui diffère de ceux obtenus lorsque les glycolipides sont ajoutés "in vitro" à des lymphocytes spléniques où l'on observe alors une stimulation des cellules B, s'explique si l'on admet que la cellule cible du MHS ou du MTP injecté chez l'animal est le macrophage. Ces monocytes sont capables après stimulation par le MHS de relâcher l'interleukine 1, une monokine qui provoque la prolifération des cellules T. L'utilisation de MTP marqué au tritium a permis de vérifier que la radioactivité se retrouve en quantité détectable au niveau de la rate 3 heures après son injection ainsi que dans les ganglions lymphatiques. L'addition de ce même MTP marqué à des macrophages péritonéaux incubés "in vitro" se traduit par une intéraction stable avec la membrane du macrophage qui ne fait pas intervenir un récepteur spécifique mais rend possible le déclenchement du relâchement d'interleukine 1. L'injection du MTP à des rats porteurs de tumeurs (adénocarcinome mammaire) permet, lorsque ceux-ci ont été sensibilisés avec une dose sous optimale de cellules tumorales viables, de provoquer un rejet complet de la tumeur primaire alors que les animaux sensibilisés mais non traités ne montrent qu'un ralentissement de la croissance tumorale. À l'inverse, l'utilisation de cellules tuées ou une fraction antigénique soluble extraite au KCl 3M pour immuniser l'animal n'apporte aucune protection contre une dose optimale subséquente en présence ou en l'absence de glycolipide. Ces résultats indiquent que la tumeur utilisée est faiblement antigénique et que la viabilité des cellules est un prérequis nécessaire au développement d'une réaction immunitaire antitumorale. Dans ce cas, le MTP en provoquant un relâchement accru d'interleukine 1 par les macrophages responsables de la présentation de l'antigène aux précurseurs des cellules T inductrices, permet une meilleure différentiation de ces lymphocytes qui peuvent proliférer. Ils produisent dans un deuxième temps la différentiation des cellules T cytotoxiques qui deviennent alors capables de tuer spécifiquement les cellules tumorales. Ce phénomène peut cependant être rendu inopérant par la présence de macrophages suppresseurs dont l'existence a été démontrée dans la rate des animaux porteurs de la tumeur mammaire et sur lesquels le MTP ne semble avoir aucun effet. Nous en concluons que les glycolipides synthétiques stimulent de façon non spécifique le système immunitaire et qu'une certaine immunogénicité de la tumeur est nécessaire pour obtenir une activité antitumorale significative

Rôle de ICAT (inhibitor of b-catenin and TCF4) dans le développement normal et pathologique des mélanocytes

-caténine, protéine multifonctionnelle et pivot de la voie de signalisation Wnt est impliquée dans de nombreux processus physiologiques, notamment le développement normal du lignage mélanocytaire. Les régulateurs négatifs directs de b-caténine sont peu nombreux et un nombre réduit d études leur a été consacré. La protéine ICAT est l un de ces régulateurs négatifs. En effet, elle se fixe au niveau des répétitions ARM 5 à 12 de b-caténine via un domaine N-terminal en hélices a et un domaine C-terminal semblable à un feuillet b, empêchant son interaction avec les facteurs de transcription TCF/LEF et donc la transcription des différents gènes cibles de b-caténine. L invalidation complète de ICAT chez la souris entraîne des anomalies développementales des dérivés des crêtes neurales responsables, dans certains cas, de la mort des animaux. Afin de déterminer la fonction de ICAT durant le développement des mélanocytes, qui sont également des dérivés des crêtes neurales, nous avons généré des embryons totalement invalidés pour le gène ICAT et exprimant le transgène Dct::LacZ. Cette invalidation n affecte ni le nombre, ni la localisation des mélanoblastes. Ces résultats suggèrent que la prolifération et la migration de ces cellules aux stades étudiés (E13.5, E15.5 et E18.5) est normale en absence de ICAT. La voie de signalisation Wnt étant dérégulée dans 30% des mélanomes, il nous a paru essentiel d examiner le rôle de ICAT dans la formation et la progression des mélanomes. L étude d un panel de lignées cellulaires de mélanome humain nous a permis de corréler une forte expression de ICAT à la formation de métastases chez des souris immunodéficientes. De plus chez l Homme, une forte expression d ARNm de ICAT dans certains mélanomes est associée à un temps de survie plus faible. La surexpression de ICAT dans différentes lignées humaines de mélanome conduit à une augmentation de la vitesse de migration des cellules en 2D et de leurs capacités invasives en 3D, sans affecter leur prolifération. L ensemble de ces effets dépend entièrement de l interaction de ICAT avec b-caténine. Au niveau cellulaire, une expression ectopique de ICAT induit une modification de la morphologie des cellules métastatiques, qui passent d une forme allongée/mésenchymateuse à une forme arrondie/amiboïde, alors qu elle n affecte pas la morphologie allongée des cellules non métastatiques. Cette modification de morphologie cellulaire s accompagne d une diminution de l expression de la protéine NEDD9, une cible de b-caténine, impliquée dans la voie de signalisation Rac communément associée à la migration mésenchymateuse. L ensemble de ces résultats nous a permis de montrer pour la première fois que ICAT est un nouveau régulateur de la motilité et de l invasion des cellules de mélanome. L étude de la structure tridimensionnelle du complexe ICAT/b-caténine nous a permis de comprendre le mécanisme de compétition entre ICAT et les facteurs TCF/LEF pour la liaison à b-caténine. Par mutagenèse, nous avons mis en évidence que les résidus D66, F71 et E75 (domaine C-terminal de ICAT) sont impliqués dans la compétition avec LEF1 mais n empêchent pas la formation d un complexe stable ICAT/b-caténine alors que les résidus Y15, K19, V22 du domaine N-terminal sont essentiels à la formation de ce complexe.-catenin is the central protein of the Wnt signaling pathway, which is involved in many physiological processes including normal melanocyte development. Few direct negative regulators of b-catenin have been described so far and their physiological role is still unclear. One of them, ICAT (inhibitor of b-catenin and TCF-4) has been identified in a yeast two-hybrid screen by using the Armadillo (ARM) region of b-catenin as bait. This small protein of 81 amino-acids, encoded by the highly conserved CTNNBIP1 gene, binds to b-catenin through ARM repeats 5 to 12, preventing its interaction with TCF4 and thus, repressing TCF/LEF-b-catenin transcriptional activity in vitro. Total invalidation of ICAT in mouse leads to premature death and cranio-facial anomalies, suggesting an important role in neural-crest cell differentiation. In order to determine the possible role of ICAT in melanoblasts development, ICAT -/- embryos, on a Dct::LacZ background were obtained. We observed that the total invalidation of the ICAT gene does not affect the number of melanoblasts and their localization at embryonic stages E13.5, E15.5 and E18.5, indicating that ICAT alone does not play a significant role in the proliferation and migration of melanoblasts during mouse development. The Wnt signaling pathway is deregulated in 30% of melanomas, so we found it essential to study the role of ICAT in the formation and progression of melanoma. We observed that high ICAT levels in a panel of human melanoma cell lines correlated with their capacity to form metastases in nude mice and was associated, in some melanoma patients, with reduced distant metastasis-free survival. Ectopic expression of ICAT in various melanoma cell lines had no effect on their proliferation but increased their in vitro motility in 2D and matrigel invasion in 3D. These in vitro effects required stable protein interaction between ICAT and b-catenin. At the cellular level, ICAT promoted switching of metastatic melanoma cells from an elongated/mesenchymal towards a round/amoeboid phenotype but did not affect the elongated morphology of non-metastatic melanoma cells. Transition from a mesenchymal to an amoeboid movement was associated with decreased production of the scaffold protein NEDD9 and decreased levels of Rac1-GTP, a positive regulator of mesenchymal movement. In vivo, ectopic ICAT expression increased lung colonization by melanoma cells in nude mice. Our results indicate that ICAT-induced down-regulation of Rac signaling can increase motility and invasiveness of metastatic cells by promoting morphological variability allowing tumor cells to adapt to their microenvironment. We show, for the first time, that ICAT is a new potential modulator of melanoma cells invasion. Based on a three-dimensional study of ICAT in complex with b-catenin we understood how ICAT competes with members of the TCF/LEF family at the nuclear level. By site directed mutagenesis, we demonstrated that D66, F71 and E75 residues (C-terminal domain of ICAT) are involved in the competition with LEF1 but are not essential in the formation of a stable ICAT/b-catenin complex, while Y15, K19, V22 residues (N-terminal domain) are essential for the formation of this complex.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

Molecular and cellular bases of syndromic craniosynostoses

International audiencePremature fusion of cranial sutures underlies the clinical condition of 'craniosynostosis', a common human disorder that occurs in both nonsyndromic and syndromic forms. The subgroup of syndromic craniosynostoses usually associates limb abnormalities and facial dysmorphism to skull distortion. Over the past decade, some of the genes causing these phenotypes have been identified. Among these, the gene encoding FGFR2, one of four members of the fibroblast growth factor receptor(FGFR) family, has been shown to account for several severe conditions including Apert, Pfeiffer, Crouzon, Beare-Stevenson and Jackson-Weiss syndromes. Two other FGFRs, FGFR1 and FGFR3, also account for craniosynostoses of variable severity [Pfeiffer, Crouzon with acanthosis nigricans (a pre-malignant skin disorder), and Muenke syndromes]. By contrast,Saethre-Chotzen syndrome and craniosynostosis (Boston-type) arise from mutations in the Twist and muscle segment homeobox 2 (MSX2) transcription factors, respectively. Whereas most FGFR mutations are likely to cause ligand independent activation of the receptor, leading to an upregulation of signaling pathways, mutations in the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor Twist appear to induce loss of protein function. This review will summarise and discuss some of the cellular and molecular mechanisms involved in normal and abnormal craniofacial development, focusing on the possible interactions between the different factors controlling membranous ossification

Le syndrome de Saethre-Chotzen, identification du gène responsable et étude fonctionnelle de la protéine H-Twist

PARIS5-BU-Necker : Fermée (751152101) / SudocSudocFranceF

Migration des cellules du lignage mélanocytaire

Au cours du développement embryonnaire chez les vertébrés, la migration des mélanocytes et de leurs précurseurs, les mélanoblastes, le long de l’axe dorso-latéral et le franchissement de la membrane basale séparant le derme de l’épiderme permettent leur localisation au niveau des zones interfolliculaires et folliculaires des poils. La transformation néoplasique convertit les mélanocytes en cellules de mélanome fortement invasives pouvant adopter deux modes de migration interconvertibles. Cette revue décrit comment les mutants naturels de souris, les modèles générés par ciblage génique et les systèmes de culture in vitro, ont permis l’identification des gènes, des voies de signalisation et des mécanismes qui régulent la migration des cellules normales et pathologiques du lignage mélanocytaire