Chemical and biological factors influencing heavy metal mobilisation in the rhizosphere: implications for phytoremediation

The thesis aims at investigating the potential of phytoremediation on a heavy metal contaminated soil with very low nutrient content, low organic carbon and acidic pH. The soil originates from the Ronneburg mining district in Thuringia (Germany) which was the third largest uranium-producing area worldwide. The mining activities strongly altered the hydrogeology of the area. The acidic and highly mineralised solutions caused by leaching of waste heaps infiltrated into the soil and underlying sediments and polluted the water-soil system with high concentrations of Mn, Al, Ni, U, and Rare Earth Elements (REE). Despite remediation activities since the 1990s, contamination is still measurable. Since the soil pH is quite low (pH 4-4.5), the mobility and bioavailability of trace elements is high and so the amounts taken up by plants are significant. So, to study the interaction between soil trace elements and plants, in particular via root exudates, four plant species were chosen: Triticale (× Triticosecale), sunflower (Helianthus annuus), red fescue (Festuca rubra) and red clover (Trifolium pratense), grown as monoculture and polyculture. The last two were used for microbial studies, including the isolation and characterisation of endophytes potentially useful for remediation enhancement. The substrate at the study area has been extensively characterised, and sequential extraction already allowed predictions about possible bioavailability of metals. However, the active influence of plants and their root exudates were not taken into consideration. Therefore, in a first part, REE will be used as a way to study root impact on element mobilisation, by comparing leaching by different organic and inorganic solutions. REE form a consistent group of so called metals, whose pattern, resulting from normalisation to a standard, can be used to describe different processes of dissolution and preferential precipitation. Our study shows that metals (REE) are mobilised in a different way by acidic solutions of different origin, and that organic acids lead to a different fractionation than inorganic ones. REE pattern changes were also observed in plants and their rhizosphere. The amounts of soluble trace elements decreased in the rhizosphere zone, while pH increased. Based on the analysis of REE patterns, it seemed that organic substances, like organic acids were an important factor that mobilises metals in the rhizosphere and allows their uptake into the plant. Furthermore, combined cultivation generally had a beneficial effect on plant growth; plants showed later necrosis and had a higher biomass production in relation to the initial seed quantity. Plants also had a clear effect on the soil structure: especially clover and red fescue were producing extended root networks, holding the soil. Festuca especially retained water. These features were considered to be interesting for remediation in sites with an erosion risk. Microorganisms living around and inside the plants also influence their growth and mineral uptake. If more is known about these, they can be used, if chosen well, to enhance phytoremediation processes, especially on soil poor in nutrients. In the present study we concentrated on bacteria living inside the plant tissues, and isolated, characterised and finally identified the cultivable ones. 78 stable, morphologically distinct isolates were obtained, belonging to 32 genera, although 12 isolates could not be identified. The identified endophytic community was different for the 2 studied plants, so it seems that a selection took place. The endophytic bacteria showed additionally clear spatial compartmentalisation within the plant, suggesting that they can form specific associations with plant tissue. Furthermore, the specificity of some strains for some compartments suggests that different uptake mechanisms for different plant tissues exist. They were found to be more diverse in the upper parts of the plants. Nevertheless, several strains isolated from roots could not be identified. Many of the isolated genera are very similar to known plant endophytes, and a large number of them are also related to strains used to support phytoremediation, mostly on sites contaminated with organic pollutants. A number of isolates demonstrated the capacity to produce plant growth promoting substances and resistance to the trace elements enriched in the contaminant soil. As a consequence, some of these strains were used to promote growth of Festuca rubra and Trifolium pratense, and were inoculated separately to each plant and also as bacterial consortia of 2 or 3 strains. The inoculated plants showed better growth, higher plant density, healthier appearance, better and denser developed root network which, by consequence, was leading to a better soil structure. Moreover, the inoculated plants showed a higher photosynthetic efficiency, which can be interpreted as an improved fitness due to a better stress resistance. Further, the positive effect of the bacteria is enhanced in case consortia of strains are used. The effect of bacteria on trace element mobility and metal uptake depends mainly on the element itself: for instance Al was less present in the soluble fraction of the soil, and Mn more mobile in the soil after the combined action of plants and microbial consortia. Zn on the other hand was not influenced. As the studied plants have a clear influence on metal mobility and pH, it is useful to use wisely their properties for remediation purposes. There is a large number of symbiotic bacteria described, which are living inside their tissue, and a notable part of them show promising properties for the support of plant growth and remediation. We suggest therefore using Festuca and Trifolium as complement to extracting, hyper-accumulating plants or to stabilising plants, in order to increase soil fertility and protection of soil erosion via the dense root network. Festuca is more influenced by bacteria concerning its root development, so should therefore get particular attention when it comes to choosing plant populations for remediation. It is also of importance to combine plants of different species to ensure long-term system stability.Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Potenzials für Phytoremediation auf einem mit Schwermetallen kontaminierten Boden mit sehr geringem Nährstoffgehalt, niedrigem organischem Kohlenstoffgehalt und saurem pH-Wert. Der Boden stammt aus dem ehemaligen Bergbaugebiet Ronneburg in Thüringen (Deutschland), das der drittgrößte Uranproduzent weltweit war. Die Bergbauaktivitäten veränderten tiefgehend die Hydrogeologie des Gebietes. Die sauren und stark mineralhaltigen Abwässer, die durch Auslaugen der Halden entstanden, sickerten in den Boden und kontaminierten das Wasser-Boden-System mit hohen Mengen an Mangan, Aluminium, Nickel, Uran sowie Seltenen Erdelementen (SEE). Trotz umfangreicher Sanierungsaktivitäten seit den 1990er Jahren xx ist die Kontamination noch an vielen Stellen messbar. Da der Boden-pH ziemlich sauer ist (pH 4-4,5), ist die Mobilität und Bioverfügbarkeit von Spurenelementen hoch und die von Pflanzen aufgenommen Mengen signifikant. Um die Wechselwirkung zwischen Bodenelemente und Pflanzen zu untersuchen, insbesondere durch die Wurzelexudate, wurden vier Pflanzenarten ausgewählt: Triticale (× Triticosecale), Sonnenblumen (Helianthus annuus), Rotschwingel (Festuca rubra) und Rotklee (Trifolium pratense), die als Monokutur sowie als Polykultur kultiviert wurden. Nur die beiden letzten Pflanzenarten wurden für spätere mikrobiologische Untersuchungen verwendet, insbesondere für die Isolierung und Charakterisierung von potentiell nützlichen Endophyten in Hinblick auf Sanierungszwecke. Das Substrat wurde umfassend charakterisiert und mithilfe sequentieller Extraktion konnten bereits Aussagen über den bioverfügbaren Metallanteil getroffen werden. Allerdings wurde der aktive Einfluss von Pflanzen und deren Wurzelausscheidungen nicht berücksichtigt. Daher werden im ersten Teil SEE zur Hilfe gezogen, um den Einfluss von Wurzelexudaten zu untersuchen, indem Elutionen mittels verschiedener organischer sowie anorganischer Lösungen und die daraus entstandenen SEE Muster verglichen werden. SEE bilden eine konsistente Gruppe von so genannten Metallen, deren Muster, das sich aus der Normalisierung zu einem Standard ergeben, für die Beschreibung unterschiedlicher Lösungs- und Präzipitationsprozesse benutzt werden kann. Unsere Studie zeigt, dass Metalle (inkl. SEE) in unterschiedlicher Weise durch verschiedene saure Lösungen mobilisiert werden und dass organischen Säuren zu einer anderen Fraktionierung führen als anorganische. SEE-Muster Veränderungen wurden auch in den Pflanzen und in ihrer Rhizosphäre beobachtet. Die Menge löslicher Spurenelemente nahm in der Rhizosphärenzone ab, während der pH-Wert zunahm. Basierend auf der Analyse von SEE-Mustern scheint es, dass organische Substanzen wie organische Säuren ein wichtiger Faktor sind, der Metalle in der Rhizosphäre mobilisiert und deren Aufnahme in die Pflanze ermöglicht.Weiters ergab sich, dass die Polykultur einen positiven Effekt auf die Pflanzen hatte; sie zeigten später Nekrosen und hatten eine höhere Biomasseproduktion in Bezug auf die ursprüngliche Menge Samen. Die Pflanzen hatten auch eine deutliche Wirkung auf die Bodenstruktur: vor allem Klee und Rotschwingel produzierten ein stark ausgebildetes Wurzelnetzwerk, das den Boden festigt; insbesondere Festuca konnte dadurch viel Wasser zurückhalten. Diese Eigenschaften sind vor allem für die Sanierung von Standorten mit Erosionsgefährdung wichtig. Die Pflanzen und ihre Spurenelement-Aufnahme können durch viele andere Faktoren beeinflusst werden, da sie einen eigenen Mikrokosmos in ihrer Rhizosphäre bilden. Mikroorganismen, die um und in der Pflanze leben, beeinflussen ebenfalls deren Wachstum und Mineralstoff-Aufnahme. Wenn mehr über diese bekannt ist, können sorgfältig ausgewählte unter ihnen verwendet werden, um Phytosanierungsprozesse, inbesondere auf nährstoffarmen Böden zu verbessern. In der vorliegenden Studie wurde der Fokus auf Bakterien, die innerhalb des Pflanzengewebes leben, gerichtet und die kultivierbaren unter ihnen wurden isoliert, charakterisiert und schließlich identifiziert. Es ergaben sich 78 stabile, morphologisch unterschiedliche Isolate, aus 32 Gattungen; 12 Isolate konnten aber nicht identifiziert werden. Die identifizierte endophytische Population war unterschiedlich für die 2 untersuchten Pflanzen, anscheinend fand eine Selektion statt. Die endophytischen Bakterien zeigten außerdem eine klare räumliche Trennung innerhalb der Pflanze, was darauf hindeutet, dass sie charakteristische Assoziationen mit bestimmten pflanzlichen Geweben bildeten. Darüber hinaus deutete die Spezifität einiger Stämme für bestimmte Kompartimente auf unterschiedliche Aufnahmemechanismen für unterschiedliche Pflanzengewebe hin. Die Diversität war größer in den oberen Pflanzenteilen. Allerdings konnten mehrere Stämme aus den Wurzeln nicht identifiziert werden. Viele der gefundenen Gattungen sind bekannten Pflanzenendophyten ähnlich und viele von ihnen werden auch verwendet, um Phytosanierung zu unterstützen, vor allem auf Standorten, die mit organischen Kontaminanten belastet sind. Eine beachliche Anzahl der Isolaten zeigte Resistenz gegen toxische Metalle, die in dem Substrat vorhanden sind, sowie die Fähigkeit, Pflanzenwachstum fördernde Substanzen zu bilden. Daher wurden einige dieser Stämme verwendet, um das Wachstum von Festuca rubra und Trifolium pratense zu fördern; sie wurden einzeln sowie als Konsortien von 2 oder 3 Stämmen inokuliert. Die inokulierten Pflanzen zeigten ein besseres Wachstum, eine höhere Pflanzendichte, gesünderes Aussehen, ein besser und dichter entwickeltes Wurzelsystem, das zu einer besseren Bodenstruktur führte. Die inokulierten Pflanzen zeigten außerdem eine höhere photosynthetische Effizienz, die als eine verbesserte Stressresistenz interpretiert werden kann. Weiters ist die positive Wirkung der Bakterien erhöht, wenn mikrobielle Konsortien verwendet werden. Die Wirkung von Bakterien auf Spurenelement-Mobilität und Metallaufnahme hängt vor allem von dem Element selbst ab: zum Beispiel war Aluminium nach der kombinierten Wirkung von Pflanzen und mikrobiellen Konsortien in geringeren Mengen in der löslichen Fraktion des Bodens vorhanden und Mangan im Gegenteil mobiler im Boden. Zink andererseits wurde nicht beeinflusst. Da die verwendeten Pflanzen eine klare Wirkung auf die Metallmobilität und den pH-Wert zeigen, ist es von Vorteil diese Eigenschaften gezielt zu nutzen. Eine große Anzahl an endosymbiotischen Bakterien wurde beschrieben und ein großer Anteil davon zeigt vielversprechende Eigenschaften für die Verbesserung von Pflanzenwachstum und Phytoremediation. Wir empfehlen daher die Verwendung von Festuca und Trifolium als Ergänzung zu extrahierenden, Metall-Hyperakkumulator Pflanzen, oder zu stabilisierenden Pflanzen, um einerseits die Bodenfruchtbarkeit zu erhöhen und andererseits als Erosionsschutz wegen des dichten Wurzelwerks. Am meisten wird die Wurzelentwicklung von Festuca durch Bakterien beeinflusst, daher sollte bei der Auswahl von Pflanzenarten für die Sanierung dieser Pflanze besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Es könnte auch hilfreich sein, Pflanzen verschiedener Arten zu kombinieren, um eine langfristige Stabilität des Systems zu gewährleisten

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